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Actividad antioxidante de los alcaloides de Bocconia arborea. Estudio sobre seis métodos de análisis (Antioxidant activity of alkaloids from Bocconia arborea. A study on six testing methods)

De
17 pages
Resumen
El fraccionamiento de la actividad antioxidante dirigida por actividad, junto con el análisis químico, llevaron al aislamiento de tres alcaloides de benzofenantridina del extracto de metanol de la corteza de Bocconia arborea. La identificación se basó en métodos espectroscópicos. Se analizó la actividad antioxidante de los alcaloides aislados 6-acetonildihidroqueleritrina, queleritrina y dihidroqueleritrina en ensayos de tiocianato, la actividad de barrido de los radicales libres, el método de decoloración del b-caroteno y el ensayo de la desoxirribosa. Todos los alcaloides mostraron actividad antioxidante significativa en ácido linoleico y b-caroteno. Además de conceder protección frente a la desoxirribosa, la peroxidación liposómica y los lípidos microsomiales de la peroxidación, también presentaron efectos de barrido en los radicales de 1,1-difenil-2-picrilhidrazil.
Abstract
Antioxidative activity-guided fractionation together with chemical analysis led to the isolation of three benzophenanthridine alkaloids from methanol extract of the bark of Bocconia arborea. Identification was based on spectroscopic methods.
The isolated alkaloids 6-acetonyldihydrochelerythrine, chelerythrine and dihydrochelerythrine were tested for antioxidative activity on thiocyanate assays, free radical scavenging activity, b-carotene bleaching method, and deoxyribose assay. All alkaloids exhibited significant antioxidant activities in linoleic acid and b-carotene. Although afforded protection against the damage of deoxyribose, liposome peroxidation and microsomial lipid from peroxidation, also exhibited scavenging effects on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals.
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ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS ALCALOIDES DE BOCCONIA ARBOREA. ESTUDIO SOBRE SEIS MÉTODOS... 5TRABAJOS ORIGINALES
ORIGINAL WORKS
Actividad antioxidante de los alcaloides de
Bocconia arborea. Estudio sobre seis métodos
de análisis
Antioxidant activity of alkaloids from Bocconia arborea. A study on six
testing methods
1 2 3 3 3PÉREZ RM, VARGAS R, MARTÍNEZ FJ , GARCÍA EV, HERNÁNDEZ B.
1 Laboratorio de Investigación de Productos Naturales. Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias
extractivas IPN. Punto fijo 16, col. Torres Lindavista cp 07708, México D.F. México.
2 Laboratorio de Investigación de Fitofarmacología .Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco A.P. 23
181 México D.F., México
3 Departamento de Química. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología. IPN. Av. Acueducto S/N,
Barrio la laguna Ticomán, cp 07340, México D.F., México
RESUMEN
El fraccionamiento de la actividad antioxidante dirigida por actividad, junto con el análisis químico, llevaron al
aislamiento de tres alcaloides de benzofenantridina del extracto de metanol de la corteza de Bocconia arborea. La
identificación se basó en métodos espectroscópicos. Se analizó la actividad antioxidante de los alcaloides aislados 6
acetonildihidroqueleritrina, queleritrina y dihidroqueleritrina en ensayos de tiocianato, la actividad de barrido de
los radicales libres, el método de decoloración del caroteno y el ensayo de la desoxirribosa. Todos los alcaloides
mostraron actividad antioxidante significativa en ácido linoleico y caroteno. Además de conceder protección frente
a la desoxirribosa, la peroxidación liposómica y los lípidos microsomiales de la peroxidación, también presentaron
efectos de barrido en los radicales de 1,1 difenil 2 picrilhidrazil.
ABSTRACT
Antioxidative activity guided fractionation together with chemical analysis led to the isolation of three benzophenanthridine
alkaloids from methanol extract of the bark of Bocconia arborea. Identification was based on spectroscopic methods.
The isolated alkaloids 6 acetonyldihydrochelerythrine, chelerythrine and dihydrochelerythrine were tested for antioxidative
activity on thiocyanate assays, free radical scavenging activity, carotene bleaching method, and deoxyribose assay. All
alkaloids exhibited significant antioxidant activities in linoleic acid and carotene. Although afforded protection against
the damage of deoxyribose, liposome peroxidation and microsomial lipid from peroxidation, also exhibited scavenging
effects on the 1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl radicals.
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
La Bocconia arborea (Papaveraceae) se co Bocconia arborea (Papaveraceae) is commonly
noce comúnmente como “palo sagrado”. Es un know as “palo sagrado”. It is a common tree that
árbol común que crece de forma salvaje y abun grows wild and abundantly in the fields of Mexico
da en los campos de México en los estados de in the states of Durango, Jalisco, Nayarit, Mi
Durango, Jalisco, Nayarit, Michoacan, Morelos, choacan, Morelos, Sinaloa, Oaxaca, Guerrero,
Sinaloa, Oaxaca, Guerrero, Veracruz y San Luis Veracruz, and San Luis Potosi. A water extract
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbR. M. PÉREZ G, R VARGAS S, F J MARTÍNEZ M, E V GARCÍA B y B HERNÁNDEZ C.6
de Potosí. En la medicina popular se utiliza un of the fresh bark is used in folk medicine for the
extracto acuoso de la corteza fresca para el tra cure of different illnesses. Aqueous bark extract
tamiento de diversas enfermedades. El extracto has long been used for treating diabetes, cancer,
acuoso de corteza se ha utilizado durante mucho inflammatory afflictions, and bacterial infection
tiempo para el tratamiento de la diabetes, el cáncer,and it is generally believed to produce beneficial
los problemas inflamatorios y las infecciones effects. A previous report on Bocconia arborea
bacterianas, y la creencia generalizada es que the presence of the alkaloids:
tiene efectos benéficos. Un informe anterior so 6 acetonyldihydrochelerythrine, dihydroche
bre la Bocconia arborea indicó la presencia de lerythrine, chelerythrine chelerythridimerine, san
1 los alcaloides siguientes: guinarine, dihydrosanguinarine, oxysanguinarine
3 6 acetonildihidroqueleritina, dihidroqueleri . Antimicrobial, cytotoxic and anti inflammatory
trina, queleritrina, queleritridimerina, sanguina activities of these alkaloids has been reported by
1 3 3 5rina, dihidrosanguinarina, oxisanguinarina . La numerous authors . In this paper, we isolate
actividad antimicrobiana, citotóxica y antinfla and purify dihydrochelerythrine, 6 acetonyldi
matoria de estos alcaloides ha sido confirmada hydrochelerythrine and chelerythrine from me
4 6por numerosos autores . En el proceso descrito thanol extract of Bocconia arborea. Due to the
en este artículo aislamos y purificamos dihidro complexity of the oxidation antioxidation pro
queleritrina, 6 acetonildihidroqueleritrina y que cesses, it is obvious that no single testing me
leritrina de extracto de metanol de Bocconia thod is capable of providing a comprehensive
arborea. Debido a la complejidad de los proce picture of the antioxidant profile of a studied
sos de oxidación y antioxidación, es obvio que sample. The aim of the present study was to used
no existe un único método de prueba que reflejesix methods widely employing for the evalua
de forma completa el perfil antioxidante de la tion of antioxidant activity, namely 2.2´ diphenyl
muestra estudiada. El objetivo del presente estu 1 1 picrylhydrazyl radical (DPPH), carotene
dio era emplear seis métodos ampliamente utili bleaching method, thiocyanate assays, deoxyri
zados para la evaluación de la actividad antioxi bose Assay, protecting liposome from peroxyl
dante, llamados radical 2.2´ difenil 1 1 pic radical induced peroxidation and biological lipid
rilhidrazil (DPPH), método de decoloración del peroxidation assay.
caroteno, ensayos de tiocianato, ensayo de des
oxirribosa, ensayo de peroxidación de lípidos
biológicos y protección de liposomas de la pe MATERIALS AND METHODS
roxidación inducida por radicales.
General Experimental Procedures
MATERIALES Y MÉTODOS IR: KBr , MS:70eV, Silica gel 60 (0.2 0.5mm).
NMR spectra were measured in CDCl . Chemi
3
Procedimientos experimentales generales cal shifts were referenced to TMS as the internal
1standard; coupling constants are given in Hz. H
13IR: KBr , MS: 70 eV, gel de sílice 60 (0,2 0,5 and CNMR spectra were run on a DPX 300
mm). Los espectros de RMN se midieron en MHz. Mass spectra were recorded on Jeol CC
CDCl . Las desviaciones químicas se remitieron Mate. UV: Beckman DU640 spectrophotometer.
3
al TMS como estándar interno; las constantes de
1acoplamiento se indican en Hz. Los espectros H
13y CNMR se ejecutaron en un DPX 300 MHz. Chemicals
Los espectros de masa se registraron en Jeol CC
Mate. UV: espectrofotómetro Beckman DU640. tocopherol, linoleic acid, 1,1 diphenyl 2
picrylhydrazyl (DPPH), and carotene, thio
barbituric acid (TBA), Trichloroacetic acid, 2
Productos químicos deoxy 2 ribose were purchased from Sigma
Chemical Co., St Louis, MO.
tocoferol, ácido linoleico, 1,1 difenil 2 pi
crilhidracil (DPPH) y caroteno, ácido tiobarbi
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
babbabANTIOXIDANT ACTIVITY OF ALKALOIDS FROM BOCCONIA ARBOREA. A STUDY ON SIX TESTING METHODS 7
túrico (ATB), ácido tricloroacético, 2 desoxi 2 Materials
ribosa adquiridos a Sigma Chemical Co., St Louis,
MO, EE.UU. Bocconia arborea (Papaveraceae) bark was
collected in Noxtepec, Mpo. De Tetipac, state of
Guerrero, was identified in the Department of
Materiales Botany of ENEP Iztacala UNAM, and a voucher
specimen of the plant (5268) is stored in the
Corteza de Bocconia arborea (Papaveraceae) herbarium of this Department for reference.
recolectada en Noxtepec, Mpo. de Tetipac, esta
do de Guerrero, identificada en el Departamento
de botánica de ENEP Iztacala UNAM; un espé Preparation of crude extract of B. Arborea bark
cimen de comprobación de la planta (5268) está and purification of alkaloids
guardado en el herbario de este departamento
para referencia. Dried bark (6 kg) of B. arborea was extrac
ted twice with methanol under reflux for 6 h.
The methanol extract was concentrated under
Preparación de extracto crudo de corteza de B. reduced pressure. The methanol extract was
Arborea y purificación de alcaloides concentrated under reduced pressure to produce
85 g of a dark red viscous mass, which was
Se extrajo corteza seca (6 kg.) de B. arborea subjected to silica gel chromatography. The co
dos veces con metanol bajo reflujo durante 6 lumn was developed with chloroform to give seven
bands. Finally, all fractions were tested for an horas. El extracto de metanol se concentró a
presión reducida. El extracto de metanol se con tioxidative activity. The most active fractions were
centró a presión reducida para producir 85 gr. de3, 5 and 7. Fraction 3 was the purified and used
una pasta viscosa de color rojo oscuro, que se in the preparative column (tlc) over silica gel by
sometió a cromatografía de gel de sílice. La eluting with CHCl ether 10:1, it was further
3
columna se desarrolló con cloroformo para obte crystallized from methanol, and there obtained
ner siete bandas. Por último, se comprobó la 300 mg of the alkaloid 1. Fraction 5 was sepa
actividad antioxidante de todas las fracciones. rated by silica gel by eluting with CHCl aceto
2
Las fracciones más activas fueron la 3, 5 y 7. La ne (25:1), gave 4 subfraction. Subfraction 3 was
fracción 3 se purificó y se utilizó en la columnafurther crystallized from methanol, and 200 mg
de preparación (cromatografía de capa fina) so of the alkaloid 2 were obtained. Fraction 7 was
bre gel de sílice mediante la elución con CHCl - then purified on Sephadex LH 20 column elu
3
éter 10:1, se cristalizó más del metanol y se ting with CHCL MeOH (25:3) gave 5 subfrac
3
obtuvieron 300 mg del alcaloide 1. La fracción tions. Subfraction 2 was then purified by prepa
5 se separó mediante gel de sílice y elución con rative tlc over silica gel eluting with CHCl EtOAc
3
CHCl acetona (25:1), obteniéndose la subfrac (4:1) to give 150 mg of compound 3.
2
ción 4. La subfracción 3 se cristalizó aún más a
partir del metanol, y se obtuvieron 200 mg del
alcaloide 2. A continuación se purificó la frac Antioxidant Activity Evaluation
ción 7 en una columna Sephadex LH 20 y se
elucionó con CHCL MeOH (25:3), obteniéndo Rapid screening for antioxidants. The com
3
se 5 subfracciones. Seguidamente, se purificó la pounds (0.5 L, 1:10 in chloroform) were spot
subfracción 2 mediante cromatografía de capa fina ted on silica gel sheets and development in CHCl -
2
sobre gel de sílice en elución con CHCl EtOAc acetone (25:1). Spraying with carotene linoleic
3
(4:1) para obtener 150 mg del compuesto 3. acid reagent and 0.2% solution of the stable ra
6,7dical diphenylpicrylhydrazyl, DPPH .
Evaluación de la actividad antioxidante
Tamizado rápido para obtención de antioxi
dantes. Los compuestos (0,5 L, 1:10 en cloro
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
bmmRM PÉREZ G, R VARGAS S, FJ MARTÍNEZ M, EV GARCÍA B y B HERNÁNDEZ C8
formo) se distribuyeron el láminas de gel de sílice carotene bleaching method
y se desarrollaron en CHCl acetona (25:1). Pos
2
teriormente se pulverizaron con ácido linoleico The test was carried out following the spec
8 caroteno como reactivo y una solución al 0,2%trophotometric method of Miller , based on the
6,7del radical estable difenilpicrilhidrazil, DPPH. ability of the different extracts to decrease the
oxidative bleaching on carotene in a carote
ne/linoleic acid emulsion. A 2.0 mg sample of
Método de decoloración del caroteno crystalline 8carotene was dissolved in 10 mL
of chloroform, and 1 mL of this solution was
La prueba se realizó siguiendo el método pipetted into a round bottom flask containing 20
8espectrofotométrico de Miller que se basa en la mg of linoleic acid and 200 mg of Tween 40.
capacidad de diversos extractos de disminuir la After the removal of chloroform by evaporation,
decoloración oxidativa del caroteno en una 50 mL of distilled water was added to the flask
emulsión ácida de caroteno/ácido linoleico. Se under vigorous stirring. After, 5 mL of the mix
disolvió una muestra de 2,0 mg de 8caroteno ture were pipetted into test tubes containing 0.2
cristalino en 10 ml de cloroformo, y 1 ml de esta mL of the sample (100 L), and the mixture was
solución se introdujo con una pipeta en un fras mixed wheel. For one sample the absorbance at
co de fondo redondo que contenía 20 mg de ácido470 nm was immediately measured using the
linoleico y 200 mg de Tween 40. Tras retirar el spectrophotometer, and for the other samples
cloroformo por evaporación, se añadieron 50 ml absorbance was measured after 10, 20, 30 and
de agua destilada al frasco mientras se removía 90 min of incubation in a water bath at 50 ºC.
enérgicamente. Después se introdujeron con una Each sample was read against an emulsion pre
pipeta 5 ml de la mezcla en tubos de ensayo que pared as described but without carotene (blank).
contenían 0,2 ml de muestra (100 L) y se agitó. To correct for the influence of the alkaloids
En una muestra se midió la absorbencia inme yellow color in calculating carotene degrada
diatamente con el espectrofotómetro a 470 nm, ytion rate, four aliquots (50 L) of each sample
9en las demás se midió la absorbencia tras 10, 20,were added to 5 mL of blank (blank sample) .
30 y 90 minutos de incubación al baño maría a The absorbances of the mixtures for each time
50ºC. Cada una de las muestras se comparó con point were read with a spectrophotometer, and
una emulsión preparada de la forma descrita perothe absorbance measured was subtracted from
sin caroteno (en blanco). Para corregir la in that of the corresponding sample. The degrada
fluencia del color amarillo de los alcaloides en tion rate of ? carotene was calculated by first
el cálculo de la velocidad de degradación del - order kinetics:
caroteno, se añadieron cuatro alícuotas (50 L)
de cada muestra a 5 ml de solución en blanco [ln(A /A)]/t = degradation rate (dr) of sample
0 t
9(muestra en blanco). La lectura de absorbencias
de las mezclas en cada lapso de tiempo se rea Where A = absorbance of the sample – the
0
lizó con un espectrofotómetro, y la absorbencia absorbance of blank sample at time 0 (absorban
medida se restó a la de la mezcla correspondien ce was read immediately after the addition of
te. La velocidad de degradación del caroteno alkaloids solutions).
se calculó mediante cinética de primer orden: A = absorbance of the sample absorbance
t
of blank sample at time t, and t=10 or 20 or 30
[ln(A /A )]/t = velocidad de degradación (vd) or 90 min of incubation at 50 ºC.
0 t
de la muestra
[ln(A /A)]/t = degradation rate (dr) of con
0 t
Donde A = absorbencia de la muestra – la trol sample
0
absorbencia de la muestra blanca en tiempo 0 (la
lectura de la absorbencia se realizó inmediata 50 L of distilled water was added to 5 mL
mente después de añadir las disoluciones de al of carotene emulsion and treated as the corres
caloides). ponding sample, a = absorbance of the control
0
sample at time 0, and a = absorbance of the
t
control sample at time t. Antioxidant activity was
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
bbbbmbbmmbbmbbbmbbbbACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS ALCALOIDES DE BOCCONIA ARBOREA. ESTUDIO SOBRE SEIS MÉTODOS... 9
A = absorbencia de la muestra absorbenciaexpressed as the percent of inhibition relative to
t
de la muestra blanca en tiempo t, y t=10 ó 20 óthe control using the equation:
30 ó 90 minutos de incubación a 50ºC.
dr control sample dr sample
AA% = X 10[ln(A /A )]/t = velocidad de degradación (vd)
0 t dr control sample
de la muestra de control
Se añadieron 50 L de agua destilada a 5 ml Thiocyanate Assays
de emulsión de caroteno y se trataron como la
muestra correspondiente, a = absorbencia de la Different amounts of samples dissolved in 120
0
muestra de control en tiempo 0, y a = absorben L of EtOH were added to a reaction mixture in
t
cia de la muestra de control en tiempo t. La a screw cap vial. Each reaction mixture consis
actividad antioxidante se expresó como porcen ted of 2.88 mL of 2.51% linoleic acid in EtOH
taje de inhibición relativo al control mediante la and 9 ml of 40 mM phosphate buffer (pH 7.0).
ecuación: The vial was placed in a oven at 40 ºC in the
dark. At intervals during incubation, a 0.111 mL
vd muestra de control vd muestra aliquot of the mixture was diluted with 9.7 mL
AA% = X 100
of 75% EtOH, which was followed by adding vd muestra de control
0.1 mL of 30% ammonium thiocyanate. Precise
ly 3 min after the addition of 0.1 mL of 20mM
Ensayos de tiocianato ferrous chloride in 3.5% hydrochloric acid to the
reaction mixture, the absorbance of red color was
Se añadieron diversas cantidades de muestra measured at 500 nm every 24 h. All tests were
10disueltas en 120 L de EtOH a una mezcla reac run in triplicate . In the antioxidation assay the
tiva en un vial con tapón de rosca. Cada mezclafollowing antioxidants were tested with ? toco
reactiva consistió en 2,88 ml de 2,51% de ácido pherol.
linoleico en EtOH y 9 ml de tampón de fosfato
40 mM (pH 7.0). El vial se colocó en un horno
a 40ºC en la oscuridad. A intervalos durante la Free Radical Scavenging Activity
incubación, se diluyó un alícuota de 0,111 ml de
la mezcla con 9,7 ml de EtOH al 75%, y segui The stable 1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl
damente se añadió 0,1 ml de tiocianato de amo (DPPH) radical scavenging effect of alkaloids
11 ,12nio al 30%. Exactamente 3 minutos después de were carried out as described before . Alka
añadir 0,1 ml de cloruro ferroso 20 mM en ácidoloids were mixed with 0.1 mM DPPH radical in
clorhídrico al 3,5% a la mezcla de reacción, se ethanol solution. A 20 min incubation period at
midió la absorbencia del color rojo a 500 nm room temperature was used before reading the
cada 24 h. Todas las pruebas se realizaron por absorbance at 519 nm. All the test and analyses
10triplicado . En el ensayo de antioxidación se were performed in triplicate and average. The
comprobaron con tocoferol los antioxidantes inhibitory percentage of DPPH was calculated
siguientes. according to the following equation:
absorbance (control) - absorbance (sample)
Actividad de barrido de los radicales libres % Inhibition = X 100
absorbance (control)
El efecto de barrido de los alcaloides en el
13 radical estable 1,1 difenil 2 picrilhidracil (DPPH) The ABTS radical cation model was also
11,12se realizó como se describió anteriormente . used to evaluate the free radical scavenging effect
Los alcaloides se mezclaron con 0,1 mM de ra of alkaloids by compared by determining the
dical DPPH en solución de etanol. Antes de la percentage of decolorization at 734 nm after 8
lectura de absorbencia a 519 nm se utilizó un min of reaction at room temperature. The effect
período de incubación a temperatura ambiente. of alkaloids on scavenging ABTS radical was
Todas las pruebas y análisis se realizaron por calculated from the following equation:
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
mbmbmR. M. PÉREZ G, R VARGAS S, F J MARTÍNEZ M, E V GARCÍA B y B HERNÁNDEZ C.10
triplicado y se calculó la media. El porcentaje de
absorbance (control) - absorbance (sample)
inhibición de DPPH se calculó mediante la ecua % Inhibition = X 100
absorbance (control)ción siguiente:
absorbencia (control) - absorbencia (muestra) Deoxyribose Assay
% Inhibici n = X 100
absorbencia (control)
14,15In this Assay, a Fenton reaction based
3+ 2+model containing 0.1 mM of Fe or Cu . All
También se utilizó el método de modelos de solutions were prepared freshly, 1.0 mL of the
13cationes de radicales ABTS para evaluar el efecto reaction contained 100 M of 28 mM 2 deoxy
de barrido de radicales libres de los alcaloides 2 ribose (Fluka, dissolved in KHPO KHPO
2 4 2 4
mediante la determinación del porcentaje de buffer pH 7.4), 500 L solution of various con
decoloración a 734 nm tras 8 minutos de reac centrations of the alkaloids (in buffer), 200 L
ción a temperatura ambiente. El efecto de los of 200 M FeCl and 1.04 mM EDTA (1:1 v/v),
3
alcaloides sobre el barrido de radicales ABTS se 100 L H O (1.0 mM) and 100 L ascorbic
2 2
calculó según la ecuación siguiente: acid (1.0 mM). After an incubation period of 1
h at 37 ºC the extent of deoxyribose degradation
was measured by the TBA reaction. 1.0 mL of
absorbencia (control) - absorbencia (muestra)
TBA (1% in 50 mM NaOH) and 1.0 mL of TCA% Inhibicin = X 100
absorbencia (control) were added to the reaction mixture and the tubes
were heated at 100 ºC for 20 min. After cooling
the absorbance was read at 532 nm against a
Ensayo de la desoxirribosa blank (containing only buffer and deoxyribose).
The absorbance (A1) read at the end of the ex
En este ensayo se utilizó un modelo basado periment was used for the calculation of the per
14,15en una reacción Fenton que contenía 0,1 mM centage inhibition of deoxyribose degradation by
3+ 2+de Fe o Cu . Todas las disoluciones estaban the test compound.
recién preparadas, 1,0 ml de la reacción conte Calculation were done as:
nían 100 M de 2 deoxi 2 ribosa 28 mM (Fluka,
disueltos en tampón de KH PO K HPO con pH I(%)= 100 X (A A/A )
2 4 2 4 0 1 0
7.4), 500 l de solución de diversas concentra
ciones de los alcaloides (en tampón), 200 L de A = Was the absorbance of the control reac
0
FeCl de 200 M y 1,04 mM EDTA (1:1 v/v), tion (full reaction, containing no test compounds)
3
100 L HO (1,0 mM) y 100 l de ácido ascór and A= was the absorbance in the presence of
2 2 1
bico (1,0 mM). Tras un período de incubación the inhibitor.
de 1 h a 37ºC, se midió el grado de degradación The IC value represented the concentration
50
de la desoxirribosa mediante la reacción de la of the compounds, that caused 50% inhibition.
TBA. Se añadieron a la mezcla de reacción 1,0 All experiments were carried out in triplicated.
ml de TBA (1% en 50 mM de NaOH) y 1,0 ml
de TCA y se calentaron los tubos a 100ºC duran
te 20 minutos. Tras el enfriamiento se realizó la Effect of Alkaloids in protecting liposome from
lectura de la absorción a 532 nm en contraste peroxyl radical induced peroxidation
con blanco (que contenía sólo tampón y desoxi
rribosa). La lectura de absorbencia (A1) al final Liposomes were made by sonicating soybean
del experimento se utilizó para el cálculo del lecithin in an ice water for 2 h in 10 mM phos
porcentaje de inhibición de la degradación de la phate buffer (pH 7.4). Peroxyl radical induced
desoxirribosa por el compuesto de prueba. liposomal peroxidation was conducted at 37?C,
El cálculo se realizó como sigue: briefly the reaction was initiated by adding 0.5
mM 2,2´ azobis(2 amidinopropane) dihydrochlo
I(%)= 100 X (A A/A ) ride (AAPH) to a mixture of 75 g/mL of lipo
0 1 0
some in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) whi
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
mmmmm?mmmmmmmmANTIOXIDANT ACTIVITY OF ALKALOIDS FROM BOCCONIA ARBOREA. A STUDY ON SIX TESTING METHODS 11
A = era la absorbencia de la reacción de ch included alkaloids (0, 5 and 25 g/mL). The
0
control (reacción completa, que no contenía nin absorbance at 234 nm was recorded every 5 min
guno de los compuestos de prueba) y A = era la for 2 h. A reaction process was obtained from
1
absorbencia en presencia del inhibidor. the generation of conjugated diene hydroperoxi
16El valor IC representaba la concentración de against time based on an absorbance coeffi
50
de los compuestos, que causaba una inhibición cient of . The antioxidant potency of alkaloids
de 50%. Todos los experimentos se realizaron were determined from the peroxidation lag pha
por triplicado. se period determined by the intercept at the abs
cissa in the conjugated diene concentration ver
17 sus time plot .
Efecto de los alcaloides en la protección de los
liposomas frente a la peroxidación inducida por
el radical peroxil Biological lipid peroxidation assay (protective
activity)
Los liposomas se obtuvieron mediante la so
nicación de lecitina de soja en agua helada du Microsomes were isolated from the livers of
rante 2 horas en 10 mM de tampón de fosfato Wistar male rats weighing 100 150 g. Livers were
(pH 7.4). La peroxidación liposomática inducida removed quickly and dropped into ice cold 3 mM
por el radical de peroxil se realizó a 37ºC; pocoTris HCl buffer (pH 7.4) containing 0.25 M su
después se inició la reacción añadiendo 0,5 mM crose and 0.1 mM EDTA. Microsomes were
de 2,2´ azobis(2 amidinopropano) dihidrocloru obtained as the result of centrifugation at 105,000
18ro (AAPH) a una mezcla de 75 g/ml de liposo X g for 60 min . The microsomal pellet obtai
mas en 10 mM de tampón de fosfato (pH 7.4) ned were suspended either in 0.1 M sodium
que incluía alcaloides (0, 5 y 25 g/ml). Se re phosphate buffer, pH 7.4 (control sample), or in
gistró la absorbencia a 234 nm cada 5 minutos alkaloids solution to make a total volume of 6
durante 2 h. Se obtuvo un proceso de reacción mL, respectively. Rat liver microsomes were
de la generación de hidroperóxido de dieno en elincubated at 37 ºC in 1 mL of reaction mixture
tiempo, basándose en un coeficiente de absor containing 0.05 M Tris HCl (pH 7.5), 2mM ADP,
16bencia de . La potencia antioxidante de los 0.12 mM Fe(NO) , and 0.1 mM NADPH. The
3 3
alcaloides se determinó a partir del período de lareaction was initiated by the addition of NA
fase del intervalo de peroxidación determinada DPH. After 5 min, 2mL of TCA TBA HCL re
por la interceptación en la abscisa en la concen agent (15% w/v trichloroacetic acid; 0.375%
tración de dieno conjugada frente a la línea de thiobarbituric acid; 0.25 N HCl) and 10 ?g/mL
17tiempo . of each alkaloids were added to the reaction
mixture. The solution was heated for 15 min in
a boiling water bath. After cooling, the floccu
lent precipitate was removed by centrifugationEnsayo de peroxidación de lípidos biológicos
(actividad protectora) at 1000 X g for 10 min. The absorbance of the
supernatant was determined at 535 nm. Butyla
Se aislaron micromas del hígado de ratas ted hydroxytoluene (100 M) served as a refe
macho Wistar que pesaban entre 100 y 150 gr. rence inhibitor of lipid peroxidation. The protec
tive activity was expressed as the percentageLos hígados se retiraron con rapidez y se colo
caron en 3 mM de tampón Tris HCl (pH 7.4) decrease of TBA reacting substances relative to
helado que contenía 0,25 M de sacarosa y 0,1 the control using the equation:
mM de EDTA. Los microsomas se obtuvieron
como resultado del centrifugado a 105.000 X g PA% = (a b)/a X 100
18durante 60 minutos . La bolita microsómica
obtenida se suspendió en 0,1 M de tampón de Where a is the TBA reacting substances in
fosfato sódico, pH 7.4 (muestra de control), o encontrol sample and b represents the TBA reac
19solución de alcaloides hasta sumar un volumen ting substances in sample .
total de 6 ml, respectivamente. Los microsomas
de hígado de rata se incubaron a 37ºC en 1 ml
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
mmmeemRM PÉREZ G, R VARGAS S, FJ MARTÍNEZ M, EV GARCÍA B y B HERNÁNDEZ C12
de mezcla de reacción que contenía 0,05 M de RESULTS AND DISCUSSION
Tris HCl (pH 7.5), 2 mM de ADP, 0,12 mM de
Fe(NO ) , y 0,1 mM de NADPH. La reacción se Identification of the isolated compounds3 3
inició mediante la adición de NADPH. Tras 5
1 13minutos, se añadieron a la mezcla de reacción 2 HNMR and CNMR spectrum of compounds
ml de reactivo TCA TBA HCL (15% w/v de ácido1 3 showed chemical shift of the protons and
20 tricloroacético; 0,375% de ácido tiobarbitúrico; carbons similar at benzophenanthridine alkaloids
270,25 N de HCl) y 10 g/ml de cada alcaloide. La . Also the structures were proposed on the basis
disolución se calentó durante 15 minutos en un of mass spectra, using typical fragments and
baño maría de agua hirviendo. Tras el enfria molecular ions, and as well as by comparison of
miento, el precipitado floculento se eliminó their mass spectra with literature spectra. On the
mediante centrifugado a 1000 X g durante 10 basis of spectral examination and comparison with
minutos. La absorbencia de la parte flotante se literature data the compound 1 was identified as
20, 27determinó a 535 nm. El hidroxitolueno butilado 6 acetonyldihydrochelerythrine . The compound
26(100 M) sirvió como inhibidor de referencia de 2 was identified as chelerythrine and the com
1,25la peroxidación de los lípidos. La actividad pro pound 3 was identified as dihydrochelerythrine.
tectora se expresó como la disminución porcen
tual de sustancias reactivas de TBA relativa al
control mediante la ecuación: TLC screening for antioxidant compounds
PA% = (a b)/a X 100 The alkaloids were tested for its antioxidant
activity starting with a rapid TLC screening. In
Donde a son las sustancias reactivas de TBA the first test the TLC sheet with a solution of
de la muestra de control y b representa las sus alkaloid were sprayed with carotene linoleic
19tancias reactivas de TBA de la muestra. acid reagent. The chromatogram was exposed to
daylight until the background colors was blea
ched (45 min after spraying) zones in which a
RESULTADOS Y DISCUSIÓN yellow colors persisted possessed antioxidant
activity. With the DPPH reagent the compounds
Identificación de los componentes aislados were detected as yellow spots on a violet back
ground. Only zones where the color turned from
1El espectro de compuestos 1 3 HNMR y purple to yellow within the first 30 min (after
13CNMR presentó un desplazamiento químico de spraying) were taken as positive results. All three
protones y carbonos similar al de los alcaloides compounds were positive and were subjected to
20 27de benzofenantridina . También se propusie further testing.
ron las estructuras basándose en los espectros de
masa, mediante fragmentos típicos e iones mole
culares, así como por comparación de su espec carotene bleaching method
tro de masa con los espectros de la literatura. En
base al examen de espectros y a la comparación The Table I shows the decrease in absorbance
con los datos de la literatura, el compuesto 1 se during the coupled oxidation of carotene and
20 identificó como 6 acetonildihidroqueleritrina linoleic acid. The 6 acetonyldihydrochelerythri
27. El compuesto 2 se identificó como queleritri ne, showed the most effective antioxidant activi
26na y el compuesto 3 se identificó como dihi ty among the alkaloids whereas the dihydroche
1,25droqueleritrina . lerythrine was less efficient. The carotene
bleaching test was selected for antioxidant acti
vity determination because it is carried out in an
Tamizado de cromatografía de capa fina (TLC) emulsion, a situation frequent in foods. On the
para componentes antioxidantes other hand, it is generally agreed that the oxida
tion is initiated by free radical attack; therefore,
Se comprobó la actividad antioxidante de los assays to evaluate the radical scavenging activi
alcaloides comenzando con un tamizado TLC ty are representative of the potential of a com
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
bbbmmbACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS ALCALOIDES DE BOCCONIA ARBOREA. ESTUDIO SOBRE SEIS MÉTODOS... 13
rápido. En la primera prueba, la lámina de TLC pound to retard oxidation. Among the radical
con solución de alcaloide se pulverizó con reac scavenging assays, the one based on the utiliza
tivo de ácido linoleico de caroteno. El croma tion of DPPH was chosen due to its simplicity
tograma se expuso a la luz del día hasta que losand worldwide acceptance for comparative pur
8colores de fondo se convirtieron en zonas deco poses .
loradas (45 minutos después de la pulverización),
en las que persistieron los colores amarillos que
poseían actividad antioxidante. Con el reactivo
DPPH los componentes se detectaron como pun
tos amarillos sobre un fondo violeta. Sólo se
consideraron resultados positivos las zonas en
las que el color pasó de púrpura a amarillo en
los primeros 30 minutos (tras la pulverización).
Los tres componentes fueron positivos y se so
metieron a pruebas adicionales.
Método de decoloración del caroteno
La Tabla I muestra la disminución de la ab
sorción durante la oxidación conjunta de caro
teno y ácido linoleico. La 6 acetonildihidroque
leritrina presentó la acción antioxidante más eficaz
entre los alcaloides, mientras que la eficacia de
la dihidroqueleritrina fue menor. Para la deter
minación de la actividad antioxidante se selec
cionó la prueba de decoloración del caroteno
porque se realiza en emulsión, una estado fre
cuente en alimentos. Por otra parte, es algo ge
neralmente aceptado que la oxidación se inicia
con el ataque de los radicales libres; por tanto,
los ensayos para evaluar la actividad de barrido
de radicales son representativos del potencial de
un compuesto para retrasar la oxidación. Entre
los ensayos de barrido de radicales, se eligió el
que se basa en la utilización de DPPH debido a
su simplicidad y aceptación mundial para fines
8comparativos .
TABLA 1. Actividad inhibidora de la decoloración del caroteno de la 6 acetonildihidroqueleritrina,
queleritrina y dihidroqueleritrina.
qy q
Absorbencia 470 nm
Muestra 0,0 (min) 10 (min) 20(min) 30 (min) 90 (min)
Control 0,45 0,46 0,44 0,44 0,45
6-acetonildi-hidroqueleritrina 0,46 0,32 0,26 0,19 0,16
Queleritrina 0,45 0,35 0,30 0,23 0,18
Dihidroqueleritrina 0,44 0,37 0,33 0,26 0,20
0,46 0,28 0,22 0,14 0,10-tocoferol
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
bbbbbaR. M. PÉREZ G, R VARGAS S, F J MARTÍNEZ M, E V GARCÍA B y B HERNÁNDEZ C.14
TABLE 1. carotene bleaching inhibiting activity of 6 acetonyldihydrochelerythrine chelerythrine
and dihydrochelerythrine.
Absorbance 470 nm
Sample 0.0 (min) 10 (min) 20(min) 30 (min) 90 (min)
Control 0.45 0.46 0.44 0.44 0.45
6-acetonyldi-hydrochelerythrine 0.46 0.32 0.26 0.19 0.16
Chelerythrine 0.45 0.35 0.30 0.23 0.18
Dihydrochelerythrine 0.44 0.37 0.33 0.26 0.20
0.46 0.28 0.22 0.14 0.10-tocoferol
Efecto de los alcaloides en la oxidación de áci Effect of alkaloids on the oxidation of linoleic
do linoleico acid
El efecto de los alcaloides en la oxidación del The effect of alkaloids on the oxidation of
ácido linoleico, determinado por el método del linoleic acid, determined by the thiocyanate
tiocianato, se muestra en la Tabla II. La autoxi method, are in Table II. The autoxidation of li
dación del ácido linoleico sin añadir alcaloides ynoleic acid without adding alkaloids and an
antioxidante ( tocoferol) estuvo acompañada tioxidant ( tocoferol) was accompanied by a rapid
de un rápido aumento del valor de peróxido. Se increase of peroxide value. Significant differen
observaron diferencias significativas (P< 0.05) ces (P< 0.05) in peroxide value were found bet
en el valor de peróxido entre el control y el ácido ween the control and the linoleic acid containing
linoleico que contenía alcaloides o antioxidante. alkaloids or antioxidant. The antioxidative acti
La actividad antioxidante de los alcaloides au vity of the alkaloids increased with concentra
mento con la concentración hasta 12,5 g/ml y tion up to 12.5 g/mL and decreased at higher
disminuyó a concentraciones más altas de alca concentrations of alkaloid, that is, 200 g/mL.
loide, es decir, de 200 g/ml. Esto se puede deber This might be explained by the fact that at hig
al hecho de que a mayores concentraciones los her concentrations alkaloids acts as oxygen ca
28alcaloides actúan como agentes portadores de rrying agent and serves as a pro oxidant in the
28oxígeno y sirven como pro oxidantes en la co oxidation of linoleic acid. The thiocyanate test
cooxidación del ácido linoleico. La prueba del showed that at a concentration of 50 g/mL the
tiocianato mostró que con una concentración de inhibition of oxidation of linoleic acid produced
50 g/ml la inhibición de la oxidación del ácido by 6 acetonyldihydrochelerythrine, chelerythrine
linoleico producida por 6 acetonildihidroquele and dihydrochelerythrine were 73.1, 77.9, and
ritrina, queleritrina y dihidroqueleritrina fueron 70.8% respectively as compared to the blank.
del 73,1%, 77,9% y 70,8% respectivamente en Chelerythrine, showed the most effective antioxi
comparación con el blanco. La queleritrina pre dant activity among the alkaloids whereas the
sentó la mayor actividad antioxidante entre los dihydrochelerythrine was less efficient, whereas
alcaloides, mientras que la dihidroqueleritrina fue the antioxidant efficiency of tocopherol was
menos eficaz, y la eficacia antioxidante del - of 92.1 %.
tocoferol fue del 92,1 %.
Ars Pharmaceutica, 44:1; 5 21, 2003
ammambamamam