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Valor nutritivo de la harina de lombriz (Eisenia foetida) como fuente de aminoácidos y su estimación cuantitativa mediante cromatografía en fase reversa (HPLC) y derivatización precolumna con o-ftalaldehído (OPA) (Nutritional value of earthworm flour (Eisenia foetida) as a source of amino acids and its quantitative estimation through reversed phase chromatography (HPLC) and pre-column derivation with o-phthalaldehyde (OPA))

De
16 pages
M was observed. The earthworm flour was characterized by evaluating the content of some essential amino acids, such as: phenylalanine, leucine, lysine, isoleucine, methionine and valine (> 3% w/w). The findings from this work are in agreement with those from earlier studies indicating that the analytical method described in this paper may be adopted for amino acid analysis of earthworm flour samples. This species could provide an answer to the nutritional and ecological problems of some developing countries.
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VALOR NUTRITIVO DE LA HARINA DE LOMBRIZ (EISENIA FOETIDA) COMO FUENTE DE AMINOÁCIDOS... 43
Valor nutritivo de la harina de lombriz (Eisenia
foetida) como fuente de aminoácidos y su
estimación cuantitativa mediante cromatografía
en fase reversa (HPLC) y derivatización
precolumna con o ftalaldehído (OPA)
Nutritional value of earthworm flour (Eisenia foetida) as a source of amino
acids and its quantitative estimation through reversed phase
Chromatography (HPLC) and pre column derivation with o phthalaldehyde
(OPA)
1 2 2 1VIELMA RONDÓN R, OVALLES DURÁN JF, LEÓN LEAL A Y M EDINA A
1 2 Dpto. de Ciencias de los Alimentos. Dpto. de Análisis y Control. Facultad de Farmacia. Universidad de Los
Andes. Mérida 2P 5101. República Bolivariana de Venezuela. E mail: rosavvefr@yahoo.com.
RESUMEN
Las lombrices terrestres del género Eisenia foetida, son de interés nutricional ya que son una fuente rica en proteínas
(> 60% p/p, base seca). El objetivo de este trabajo fue determinar el contenido de aminoácidos proteicos en muestras
de lombrices convertidas previamente en harina. La determinación analítica requirió el diseño y validación de un
método analítico por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa y derivatización precolumna con o
ftalaldehído. El método resultó ser preciso, lineal y reproducible con una exactitud satisfactoria, en el intervalo de
concentración ensayado (2 – 32 μM). La harina de lombriz se caracterizó por un contenido representativo de algunos
aminoácidos esenciales, tales como: fenilalanina, leucina, lisina, isoleucina, metionina y valina (> 3% p/p). La lom
briz roja californiana podría constituir una solución a los problemas nutricionales y ecológicos de algunos países en
vías de desarrollo. Los resultados obtenidos concuerdan significativamente con los reportados por otros autores,
razón por la cual se propone el método analítico descrito.
PALABRAS CLAVE: Lombriz de tierra. Eisenia foetida. Aminoácidos. Cromatografía líquida. CLAR. O ftalaldehído.
OPA.
ABSTRACT
Earthworms (Eisenia foetida) are of nutritional interest since they are a rich source of protein (> 60% w/w). The aim
of this work was to determine amino acid content in proteins from samples of earthworm flour. The amino acids were
separated by reversed phase high performance liquid chromatography and detected through molecular fluorescence
subsequent to derivatization with o phthalaldehyde. The accuracy and precision of the method developed were satisfactory,
and a linear response within the concentration range of 2 32 μM was observed. The earthworm flour was characterized
by evaluating the content of some essential amino acids, such as: phenylalanine, leucine, lysine, isoleucine, methionine
and valine (> 3% w/w). The findings from this work are in agreement with those from earlier studies indicating that
the analytical method described in this paper may be adopted for amino acid analysis of earthworm flour samples. This
species could provide an answer to the nutritional and ecological problems of some developing countries.
KEY WORDS: Earthworm. Eisenia foetida. Amino acids. HPLC. O phthaldehyde (OPA).
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003VIELMA RONDÓN R, OVALLES DURÁN JF, LEÓN LEAL A y MEDINA A.44
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION

Actualmente se reconoce que la lombricultu Earthworm culturing is currently a recogni
ra es un recurso biotecnológico de elevado inte sed biotechnological source of ecological and
rés ecológico y nutricional. Esta biotecnología nutritional interest. This form of biotechnology
utiliza una especie de lombriz domesticada de uses a species of domesticated earthworm known
nominada Eisenia foetida (Lumbricidiae), con dos as Eisenia foetida (Lumbricidiae), with two main
objetivos principales, primero como una alterna objectives, firstly as an alternative to the recycling
tiva de reciclaje de desechos orgánicos de dife of organic waste products from differing sour
rentes fuentes, y segundo como una fuente de ces, and secondly as a source of low cost, un
proteína no convencional de bajo costo. La hari conventional protein. Earthworm flour is charac
na de lombriz se caracteriza por un elevado con terised by its high content in proteins (> 60% w/
tenido de proteínas (> 60% p/p, base seca) de w, dry base). It is of nutritional interest due to
interés nutricional ya que proporciona aminoáci the essential amino acids that it provides for the
1 1dos esenciales para la dieta humana . La obten human diet. Protein rich earthworm flour can be
ción a un bajo costo de la harina de lombriz ricaproduced at a low cost, given that earthworms
en proteínas se debe a que las lombrices se ali are fed from organic waste, and grow and mul
mentan de desechos orgánicos, crecen a una alta tiply at a rapid rate. It is important to point out
velocidad y se multiplican rápidamente. Es im that it is cultural prejudice and a general unaware
portante resaltar, que el prejuicio cultural y la ness of the benefits that this earthworm may
falta de información de los beneficios que pre provide that have prevented their official use in
senta esta lombriz, son los que no han permitidohuman diet. However, in some Asian countries
su utilización oficial en el campo alimenticio such as China, Japan, the Philipines, Taiwan, etc.,
1humano. Sin embargo, algunos países orientales these worms are consumed by humans. From
tales como China, Japón, Filipinas, Taiwán, etc., Californian red earthworms, not only is it possi
1la han incorporado al consumo humano. De la ble to obtain a protein rich source of meat, but
lombriz roja californiana, no sólo se obtiene carne also a source of essential amino acids, among
rica en proteínas, sino también los aminoácidos which lysine should be mentioned, given that
esenciales, entre ellos es importante mencionar a this amino acid is often absent in basic foodstu
2la lisina, aminoácido que suele estar ausente en ffs . The content of this amino acid in earthworm
2los alimentos básicos . El contenido de este flour is significant (5.9% w/w), representing ac
aminoácido en la harina de lombriz es signifi cording to WHO/FAO, the daily requirement for
3cativo (5,9% p/p), ya que satisface los requeri children between two and five.
mientos para niños entre 2 5 años exigidos por The Department of Foodstuff Sciences at the
3la FAO/OMS. Faculty of Pharmacy, University of the Andes of
El Departamento de Ciencias de los Alimen Venezuela, is studying the feasibility of inclu
tos de la Facultad de Farmacia de la Universidadding this non conventional foodstuff in school
de Los Andes de Venezuela, está estudiando la and university canteens. For this reason a pre
factibilidad de incluir este alimento no conven liminary study was carried out in order to deter
cional en los comedores escolares y universita mine the protein and amino acid content of ear
rios, razón por la cual se emprendió un estudio thworm flour obtained from a culture in the region.
preliminar para determinar el contenido de pro Additionally, the University of the Andes has
teínas y aminoácidos de la harina de lombriz made an attempt to demonstrate that it is indeed
obtenida a partir de un lombricultivo de la re possible to solve organic rubbish disposal pro
gión. Por otra parte la Universidad de Los Andesblems by transforming this waste into a useful
4intenta demostrar que sí es posible solucionar el product for agricultural purposes in accordance .
problema de la disposición final de la basura The work was carried out at a pilot compost and
orgánica, convirtiéndola en algo útil para la agri earthworm culturing station for the management
4cultura , a través de la Estación piloto de Com of waste products (Ciulamide).
postaje y Lombricultura para el Manejo Integral The objective of the present work is to apply
de los Desechos (Ciulamide). High resolution liquid chromatography (rever
sed phase HPLC), pre column derivatization with
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003NUTRITIONAL VALUE OF EARTHWORM FLOUR (EISENIA FOETIDA) AS A SOURCE OF AMINO ACIDS... 45
El objetivo del presente trabajo es aplicar la orto phthataldehyde (OPA), followed by flores
cromatografía líquida de alta resolución (CLAR, cent detection, and the determination of amino
en fase reversa) y la derivatización precolumna acid protein levels in earthworm ( Eisenia foeti
con orto ftalaldehído (OPA) seguida de detec da) flour. After combining the optimisation and
ción fluorescente, a la determinación de los ni applicability of the method, the utility of ear
veles de aminoácidos proteicos en harina de lom thworm flour as a non conventional source of
briz (Eisenia foetida). Aunado a la optimización nutrition is discussed.
y aplicabilidad del método se exponen algunos
argumentos relacionados con la utilidad de la
harina de lombriz como un recurso nutricional MATERIALS AND METHODS
no convencional.
REAGENTS: The derivatizing agent o phtha
ladehyde (OPA) was specially formulated to be
MATERIAL Y MÉTODOS used without previous preparation (containing Brij
35, methanol, 2 mercapthoethanol, potassium
REACTIVOS: Agente derivatizante o ftalal hydroxide and boric acid, pH 10.4) batch Nº P
dehído (OPA), especialmente formulado para usar 0532 (Sigma, st Louis, MO, USA). 2 mercap
sin preparación previa (contiene Brij 35, meta thoethanol, M 6250 (Sigma, St. Louis st, MO,
nol, 2 mercaptoetanol, hidróxido de potasio y ácidoUSA). Standard amino acid solution and indivi
bórico, pH 10,4) lote Nº P 0532 (Sigma, St. Louis,dual amino acids (sigma, st Louis, MO, USA).
MO, EE UU). 2 mercaptoetanol, M 6250 (Sig Secondary reactives (Riedel deHaën, Alemania).
ma, St. Louis, MO, EE UU). Solución estándar Methanol HPLC grade (Mallinckrodt, St. Louis,
de aminoácidos y aminoácidos individuales (Sig MO, USA). Distilled water Milli Q.
ma, St. Louis, MO, EE UU). Reactivos secunda
rios (Riedel deHaën, Alemania). Metanol grado EQUIPMENT: High performance liquid
HPLC (Mallinckrodt, St. Louis, MO, EE UU). Chromatograph (HPLC) with fluorescence detec
Agua destilada Milli Q. tor, model 470 (water, USA). Chromatographic
column 100 x 4,6 mm, Adsorbosphere OPA SH,
EQUIPOS: Cromatógrafo para fase líquida 5 , batch Nº 2521 (Alltech Associates Inc, USA).
de alta eficiencia (HPLC) con detector de fluo Column C18, Bondapak TM 3,9 x 300 mm
rescencia modelo 470 (Water, EE UU). Colum (Water P/N 27324). Liophylizer (labconco USA).
na cromatográfica de 100 x 4,6 mm, Adsorbos
phere OPA SH, 5 , Lote Nº 2521 (Alltech SAMPLES: Untreated earthworm sample:
Associates Inc, EE UU). Columna C18, Bonda The samples were obtained from the species
pak TM 3,9 x 300 mm (Water P/N 27324). Eisenia foetida at an adult stage of development
Liofilizador (Labconco, EE UU). (3 months), with an average length and weight
of 8.5 cm and 0.45 grms respectively, (earthworm
MUESTRAS: Muestra de lombrices sin cultures from “Luis Ruiz Terán” Herbarium at
tratamiento: Las muestras fueron obtenidas de the Faculty of Pharmacy, University of the An
la lombriz Eisenia foetida en estado adulto (3 des, Merida Venezuela). The earthworms were
meses), con una longitud y peso promedio de fed on a diet of organic waste compost, obtained
8,5 cm y 0,45 gramos respectivamente (Lombri from a university canteen in the region. In order
cultivo del herbario “Luis Ruiz Terán” de la to guarantee optimum growth conditions, the
Facultad de Farmacia de la Universidad de Los temperature, moisture and pH of the compost
Andes, Mérida Venezuela). Las lombrices fue were kept under control. Samples of the ear
ron alimentadas a base de un compostaje de thworm flour obtained from liophylization (FL):
desechos orgánicos obtenidos del comedor uni The earthworms (n=300) were thoroughly was
versitario de la región. A este compostaje se le hed and were subsequently stored for 24 hours
controló la temperatura, humedad y pH, para in an air insufflated water container. On com
garantizar el optimo crecimiento de las lombri pleting this process, the worms were frozen (li
ces. Muestra de harina de lombriz obtenida quid nitrogen) and lyophilised, degreased using
5por liofilización (HL) : Las lombrices (n = 300) the Soxhlet method , and finally ground to a
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003
mmmmVIELMA RONDÓN R, OVALLES DURÁN JF, LEÓN LEAL A y MEDINA A.46
se lavaron profusamente y luego se conservaron homogeneous flour. Samples of earthworm flo
durante 24 horas en un recipiente contentivo de ur obtained from oven drying (ODF): Up until
agua e insuflación de aire. Finalizado este pro the air insuflation process, the same methodolo
ceso, se congelaron (nitrógeno líquido) y se co gy for obtaining FL was applied. The previous
locaron en un liofilizador. Después se desgrasa ly washed earthworms, were treated with a 4%
5 1ron por el método de Soxhlet y finalmente se solution of sodium chloride . After washing with
sometieron a una molienda hasta el grado de un abundant water in order to totally eliminate the
producto harinoso homogéneo. Muestra de ha salt, the worms were heated in an oven at 60°C
rina de lombriz obtenida por secado en estufa for nine hours, followed by the same degreasing
(HSE): Se siguió la misma metodología descrita and grinding process as before. Hydrolysed
para obtener HL hasta el proceso de insuflación protein samples: The samples obtained from both
de aire. Las lombrices previamente lavadas, fue processes were weighed with 0.0200 g and 0.0202
ron tratadas con una solución de cloruro de so g obtained from FL and ODF respectively. Each
1dio al 4%. Después del beneficio se lavaron con of the samples were transferred to a amber colo
abundante agua hasta eliminar totalmente la sal ured ampoule with 2 mL of hydrochloric acid
6,7y luego se colocaron en una estufa a 60°C du (12 M) . Hydrolysis was carried out at 110° C
rante 9 horas. Finalmente se aplicó el mismo for 24 hours. The ampoules were stored at –
proceso de desgrasado y molienda. Muestras de 20ºC until preparation of the working solutions
hidrolizados proteicos: Se pesó por duplicado (one to two weeks). The product obtained from
0,0200 g de HL y 0,0202 g de HSE. Cada una de acid hydrolysis was transferred to a cylinder of
las muestras se transfirió a una ampolla (de co a capacity of 25 mL and milli Q water to make
lor ámbar) junto con 2 mL de ácido clorhídrico up volume, together with 6mL of sodium hydroxi
6,712 M . La hidrólisis se realizó a 110° C durantede 0.1 M, were added. Finally, acetic acid 30
24 horas. Las ampollas se conservaron a –20ºC mM was used to bring the solution to full volu
hasta el momento de preparar las soluciones de me (samples FL 1 & ODF 1). From these sam
trabajo (1 a 2 semanas). El producto de la hidró ples, the sample solutions FL 2 and ODF 2 were
lisis ácida se transfirió a un balón de 25 mL de prepared through dissolution 2:10 (v/v) with acetic
capacidad y se llevó a volumen con agua milli acid 30 mM. The dissolutions to be tested were
Q. Esta solución se filtró utilizando una mem prepared immediately before amino acid deriva
brana filtrante de 0,45 mm. Se midió 1 mL del tization.
filtrado, se transfirió a un balón de 10 mL junto
con 6 mL de hidróxido de sodio 0,1 M y final SOLUTION PREPARATION: Individual
mente se enrasó con ácido acético 30 mM (mues amino acid solution patterns (SP1): The equi
tras HL 1 y HSE 1). A partir de estas muestras valent of a 2 mM sample of each amino acid
se prepararon las soluciones muestra HL 2 y HSE were prepared separately, followed by the prepa
2 mediante diluciones 2:10 (v/v) con ácido acé ration of solutions equivalent to 20 M, using
tico 30 mM. Las disoluciones a ser ensayadas se30 mM acetic acid solution as solvent. All solu
prepararon inmediatamente antes de la derivati tions were transferred to amber coloured vials
zación de los aminoácidos. and were sealed in a nitrogen environment and
stored at –20ºC for one to two weeks. Mixed
PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES : amino acid solution working patterns (SP2):
Solución patrón de aminoácidos individuales A series of solutions of a mixture of individual
(SP1): se pesó por separado una muestra de cadaamino acids equivalent to a concentration of 0,
aminoácido equivalente a 2 M, y luego se pre 2, 4, 8, 12, 16, & 32 M for each amino acid
pararon soluciones de trabajo equivalentes a 20 were prepared, using the previously mentioned
mM utilizando solución de ácido acético 30 mM methodology.
como disolvente. Todas las soluciones fueron
transferidas a viales de color ámbar y sellados DERIVATIZATION: 100 mL of the solu
bajo atmósfera de nitrógeno y conservadas a – tion to be tested (standard or sample) were trans
20ºC (1 a 2 semanas). Solución patrón de tra ferred to a vial in a nitrogen atmosphere with
bajo de una mezcla de aminoácidos (SP2): se 200 L of derivatizing reactive (OPA). After
preparó una serie de soluciones de una mezcla exactly 60 seconds, 500 L of potassium borate
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003
mmmmmVALOR NUTRITIVO DE LA HARINA DE LOMBRIZ (EISENIA FOETIDA) COMO FUENTE DE AMINOÁCIDOS... 47
de aminoácidos individuales equivalentes a una buffer solution 0.4 M (pH 10) was added, and
concentración de 0, 2, 4, 8, 12, 16 y 32 M para the solution was subsequently sealed and shaken.
cada aminoácido, usando la metodología ya Given that derivatized amino acids with OPA
mencionada. are only stable for a short period of time, the
injections of OPA derivatives into the chroma
DERIVATIZACIÓN: Se transfirió 100 mL tograph were performed within two minutes,
de la solución a ensayar (patrón o muestra) a unimmediately after derivatization, as recommen
8vial bajo atmósfera de nitrógeno y 200 L del ded by the manufacturer.
reactivo derivatizante (OPA). Exactamente des
pués de 60 segundos se agregó 500 L de una CHROMATOGRAPHIC PARAMETERS:
solución buffer 0,4 M de borato de potasio (pH Mobile phase A: 50 mM of monosodium phos
10) y seguidamente se selló y agitó. Dado que phate adjusted to pH 7.2. Mobile phase B:
los aminoácidos derivatizados con OPA sólo son Methanol buffer phosphate (70:30, v/v). Flow: 2
estables por un corto periodo de tiempo, las in mL/min. Column temperature: ambient (± 20ºC).
yecciones en el cromatógrafo de los OPA deri Injection volume: 10 L. Detector: Fluorescence,
vados se realizaron dentro de los dos minutos filter 1.5 and attenuation 16 x 100. Detection:
siguientes a la derivatización tal como lo reco excitation 340 nm and emission 455 nm. Gra
8mienda el fabricante. dient (T %B curve): (0 10 concave); (35 65 con
cave); (45 90 convex).
PARAMETROS CROMATOGRÁFICOS:
Fase móvil A: 50 mM de fosfato monosódico
ajustado a pH 7,2. Fase móvil B : metanol buffer QUALITATIVE ANALYSIS OF AMINO
fosfato (70:30, v/v). Flujo: 2 mL/min. Tempe ACIDS
ratura de la columna : ambiente (± 20ºC). Vo
lumen de inyección: 10 L. Detector: Fluores Earthworm flour samples were hydrolysed with
cencia, filtro 1,5 y atenuación 16 x 100. hydrochloric acid (6 M) for 20 hours. The pH of
Detección: excitación 340 nm y emisión 455 nm.the hydrolysed product was adjusted to 2.20 with
Gradiente (T %B curva): (0 10 cóncava); (35 a Beckman System 6300 buffer solution. The
65 cóncava); (45 90 convexa). amino acids were separated using an automatic
Beckman amino acid analyser (System 126 AA)
and were derivatized with ninhydrin for detec
ANÁLISIS CUALITATIVO tion purposes at 570 nm & 440 nm.
DE AMINOÁCIDOS
ANALYSIS OF PROTEINS
The protein content of the earthworm flourLas muestras de harina de lombriz fueron hi
drolizadas con ácido clorhídrico 6 M durante 20 was determined using the micro Kjeldahl me
5horas. El pH del hidrolizado fue ajustado a 2,20 thod .
con una solución tampón Beckman System 6300.
Los aminoácidos fueron separados utilizando un METHOD VALIDATION
analizador automático de aminoácidos tipo Beck
man (System 126 AA) y derivatizados con nin SUITABILITY TEST OF THE CHROMA
hidrina para su detección a 570 nm y 440 nm. TOGRAPHIC SYSTEM. The SP2 solution
(n=10) was injected until peaks of a height of
ANALISIS DE PROTEÍNAS between 10 & 100% were obtained with regard
to the fluorometric signal response. The concen El contenido de proteínas de la harina de lom
briz fue determinado por el método de micro tration of amino acids with a lower signal were
5Kjeldahl . adjusted in order to prepare the calibration cur
ve. A range of concentrations of between nM &
VALIDACIÓN DEL MÉTODO mM were examined. In order to determine the
portion of sample and a concentration of amino
Ensayo de conveniencia del sistema croma acids within the calibration curve, a study simi
tográfico. Se inyectó la solución SP2 (n = 10) lar to that mentioned for SP2 was carried out.
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003
mmmmmVIELMA RONDÓN R, OVALLES DURÁN JF, LEÓN LEAL A y MEDINA A.48
hasta obtener picos de altura entre 10 % y 100%Identification of amino acids. Identification was
con respecto a la respuesta de la señal fluoromé carried out through individual duplicated tests of
trica. La concentración de los aminoácidos con reference materials (SP1) and a duplicated test
menor señal se ajustó para preparar la curva de of the mixture of amino acids (SP2). The pro
calibración. Se examinó un rango de concentra cess was checked using ionic interchange chro
ciones entre nM y mM. Para determinar la por matography and postcolumn derivatization with
ción de muestra y una concentración de aminoá ninhydrin. Repetitivity. Precision within the series
cidos dentro de la curva de calibrado, se efectuówas examined through quadruple injections of
un estudio similar al mencionado para la solu an intermediate solution of the series of standard
ción SP2. Identificación de los aminoácidos . Se amino acid mixtures (SP2). The calibration curve
obtuvo mediante ensayos individuales duplica was obtained through duplicated injections.
dos de materiales de referencia (SP1) y un ensa Accuracy. An intermediate solution from the se
yo duplicado de la mezcla de aminoácidos (SP2).ries of standard amino acid mixtures (SP2) were
La identificación de los aminoácidos fue com added to a sample solution FL 2 1:1, v/v (n=2).
probada utilizando cromatografía de intercambio Robustness. The identification and quantifica
iónico y derivatización postcolumna con ninhi tion of the certified amino acids were evaluated
drina. Repetitividad. La precisión dentro de se using a BondapaK C18 column, under the con
ries se examinó mediante inyecciones cuádru ditions described in materials and methods. The
ples de una solución intermedia de la serie de repetivity within and among series, with regard
patrones de la mezcla de aminoácidos (SP2). La to retention times and areas of peaks, was deter
curva de calibración se obtuvo mediante inyec mined using both columns. The final analysis of
ciones por duplicado. Exactitud. A una solución the samples was carried out using the OPA HS
intermedia de la serie de patrones de la mezcla column. Linearity. Method linearity was deter
de aminoácidos (SP2) se le adicionó una solu mined within concentration interval 2 16 M for
ción muestra HL 2 1:1, v/v (n=2). Robustez. La each amino acid (SP2). Stability. Stability tests
identificación y cuantificación de los aminoáci were not carried out given that after optimising
dos certificados fue evaluada utilizando una co the method, the samples were prepared, conser
lumna BondapaK C18 bajo las condiciones des ved at –20ºC in an atmosphere of nitrogen, and
critas en materiales y métodos. La repetitividad subsequently analysed within a period of two
dentro de series y entre series en relación a los weeks. During the daily testing period, the wor
tiempos de retención y las áreas de los picos fueking solutions were stored at 0ºC. The stabi
determinada utilizando ambas columnas. El aná lity of the derivatized amino acids was normali
lisis final de las muestras se llevó a cabo utili sed through a rigorous adherence to derivatization
8zando la columna OPA HS. Linealidad. La li times prior to chromatographic separation. The
nealidad del método se determinó en el intervalo reactive OPA was conserved at 4ºC in nitrogen
de concentración de 2 – 16 M para cada uno de atmosphere and was reconstituted every week
los aminoácidos (SP2). Estabilidad. No se reali through the addition of 5 L of 2 mercapthoethanol
zaron ensayos de estabilidad ya que después de to 1 mL of undiluted OPA reactive. During the
optimizado el método las muestras se prepara tests, the OPA reactive was manipulated in ice
ron, conservaron a –20ºC bajo atmósfera de ni bath storage and the recipient was opened in a
trógeno y luego se analizaron dentro de las dos nitrogen atmosphere. Determination of the quan
semanas siguientes. Durante el ensayo diario las tity of solution sampled to be tested. 100 L of
soluciones de trabajo se conservaron a 0ºC. La samples HL 1 and HSE 1 and 100 L of diluted
estabilidad de los aminoácidos derivatizados se sample HL 2 and HSE 2 were derivatized. Sta
normalizó mediante un seguimiento riguroso del tistical analysis of the data. The program Mi
tiempo de derivatización previo a la separación crocal Origin 5.0 was used.
8cromatográfica . El reactivo OPA se conservó a
4ºC bajo atmósfera de nitrógeno y se reconstitu
yó cada semana mediante la adición de 5 L de RESULTS AND DISCUSSION
2 mercaptoetanol a 1 mL del reactivo OPA sin
diluir. Durante los ensayos, el reactivo OPA se Liophylized (FL) and oven dried earthworm
manipuló conservándolo en un baño de hielo y flour (ODF) were characterised by their high
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003
mm££mmmmNUTRITIONAL VALUE OF EARTHWORM FLOUR (EISENIA FOETIDA) AS A SOURCE OF AMINO ACIDS... 49
se destapó el envase bajo una atmósfera de ni protein content (62.28 y 61.81% w/w, respecti
trógeno. Determinación de la cantidad de solu vely), as expected in the light of the work of
1,9,10ción muestra a ensayar. Se derivatizó 100 L other authors .
de las muestras HL 1 y HSE 1 y 100 L de las A total of 15 amino acids were identified
muestras diluidas HL 2 y HSE 2. Análisis esta through high resolution liquid chromatography
dístico de los datos. Se utilizó el programa Mi (Fig.1 & 2) and validated by ionic interchange
crocal Origin 5.0 chromatography (Fig. 3) using reference mate
rials. However, only 12 amino acids were quan
tified by HPLC. The resolution obtained for most
of the primary derivatized amino acids was sa RESULTADOS Y DISCUSIÓN
tisfactory both for standard as well as for the
sample. The isoindol derivatives of histidine,La harina de lombriz obtenida por liofiliza
11glycine and threonine, that normally co eluate ,ción (HL) y secado en estufa (HSE) se caracte
were separated under the conditions described inrizó por un elevado contenido en proteínas (62,28
the materials and methods section. The aminoy 61,81% p/p, respectivamente) como era de
1,9,10 acids methionine and valine co eluated under theesperarse según otros autores .
conditions described (Fig. 1 & 2). The lack ofUn total de 15 aminoácidos fueron identifica
resolution from this pair of amino acids is cha dos por cromatografía líquida de alta resolución
8racteristic of the methodology used. Retention(Fig.1 y 2) y validados por cromatografía de
times, between runs, for the standard curve (du intercambio iónico (Fig. 3) utilizando materiales
plicated injections), did not vary significantly (<de referencia. Sin embargo, sólo 12 aminoácidos
0.1 min), and in every case maintained the reso fueron cuantificados por CLAR. La resolución
lutions expected. Although an internal standardobtenida para la mayoría de los aminoácidos
was not used, the variation in daily and inter primarios derivatizados fue satisfactoria tanto para
daily retention times was less than 0.1 min. Pre el patrón como para la muestra. Los derivados
cision within runs, expressed as a coefficient ofisoindólicos de histidina, glicina y treonina, que
11 percentage variation (CV), for an SP2 solutionnormalmente coeluyen , fueron separados usan
tested on 4 consecutive occasions was in all casesdo las condiciones descritas en la sección de
< 5% (Table 1). A lineal interval of between 4materiales y métodos. Los aminoácidos metioni
& 16 mM was found to be adequate for the ma na y valina coeluyeron bajo las condiciones des
jority of the derivatized amino acids. However,critas (Fig. 1 y 2). La falta de resolución de este
the final concentration of some amino acids sett par de aminoácidos es propia de la metodología
8 led at between 2 & 32 mM. The coefficient ofutilizada . Los tiempos de retención, entre corri
correlation (r) fluctuated between 0.998 & 1.000das, para la curva patrón (inyecciones por dupli
(Table 1). Exactness expressed as recovery per cado), no varió representativamente (< 0,1 min),
centage oscillated between 97 and 102 for the 12manteniendo en cada caso la resolución espera
amino acids that were finally quantified. Theda. A pesar de que no se usó un patrón interno,
optimal quantity of sample solution to achieve ala variación de los tiempos de retención diario e
concentration within lineal range was 2 mL (FL interdiario fue inferior a 0,1 min. La precisión
1 or ODF 1) diluted to 10mL with acetic acid 30dentro de corridas, expresada como coeficiente
mM (HL 2 or HSE 2).de variación porcentual (CV), para una solución
The high resolution reversed phase liquidSP2 ensayada 4 veces de manera consecutiva fue
chromatograph (HPLC) adapts perfectly to theen todos los casos < 5% (Tabla 1). Un intervalo
quantification of amino acids that are producedlineal entre 4 y 16 mM resultó adecuado para la
from hydrolysed proteins from earthworm flourmayoría de los aminoácidos derivatizados, no
after derivatization with o phthaldehyde. Theobstante, la concentración final de algunos ami
method was found to be accurate, lineal and re noácidos se ajustó entre 2 y 32 mM. El coefi
producible, at the concentration interval tested.ciente de correlación (r) fluctuó entre 0,998 y
Amino acid quantification was carried out in two1,000 (Tabla 1). La exactitud expresada como
types of sample: (a) flour obtained through lio porcentaje recuperado osciló entre 97 y 102 para
phylization (FL) and (b) oven dried flour (ODF).los 12 aminoácidos finalmente cuantificados. La
The results obtained demonstrate that the diffe cantidad de solución muestra óptima para lograr
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003
mmVIELMA RONDÓN R, OVALLES DURÁN JF, LEÓN LEAL A y MEDINA A.50
una concentración dentro del rango lineal fue 2 rence between one or other sample is < 10% for
mL de muestra (HL 1 o HSE 1) diluida a 10 mL each amino acid (n = 4), except for tyrosine and
con ácido acético 30 mM (HL 2 o HSE 2). lysine. In all cases is was apparent that a greater
La cromatografía líquida de alta resolución quantity of amino acid content was achieved
(CLAR) en fase reversa se adapta perfectamente following the methodology for the production of
a la cuantificación de aminoácidos producto de liophylized earthworm flour (LF). Consequent
la hidrólisis de proteínas de la harina de lombrizly, it is this methodology that is recommended
previa derivatización con o ftalaldehído ya que for quantitative analysis.
el método resultó ser preciso, lineal y reproduci
ble, en el intervalo de concentración ensayado.
La cuantificación de aminoácidos se realizó en
dos tipos de muestra: (a) harina obtenida por
liofilización (HL) y (b) harina obtenida por se
cado en estufa (HSE). Los resultados obtenidos
demostraron que la diferencia entre una y otra
muestra es < 10% para cada aminoácido (n = 4),
excepto para tirosina y lisina. Se evidenció que
en todos los casos se obtuvo un mayor contenido
de aminoácidos siguiendo la metodología de
obtención de harina de lombriz por liofilización
(HL) por lo que se recomienda esta última para
el análisis cuantitativo.
FIGURA 1. Cromatograma (CLAR) representativo de los derivados OPA aminoacídicos de una muestra de harina de
lombriz (HL).
FIGURE 1. Chromatogram (HPLC) representing OPA amino acid derivatives of earthworm sample (FL).
Identificación:/Identification: 1 = Asp, 2 = Glu, 3 = Ser, 4 = Gly, 5 = Thr, 6 = His, 8 =
Ala, 10 = Arg, 11 = Tyr, 12 13 = Met Val, 14 = Phe, 15 = Ileu, 16 = Leu y 17 = Lys.
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003VALOR NUTRITIVO DE LA HARINA DE LOMBRIZ (EISENIA FOETIDA) COMO FUENTE DE AMINOÁCIDOS... 51
FIGURA 2. Cromatograma (CLAR) representativo de los derivados OPA aminoacídicos de una muestra de harina
de lombriz (HSE).
FIGURE 2: Chromatogram (HPLC) representing OPA amino acid derivatives of earthworm sample (ODF).
Identificación/Identification: 1 = Asp, 2 = Glu, 3 = Ser, 4 = Gly, 5 = Thr, 6 = His, 8 = Ala, 10
= Arg, 11 = Tyr, 12 13 = Met Val, 14 = Phe, 15 = Ileu, 16 = Leu y 17 = Lys.
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003VIELMA RONDÓN R, OVALLES DURÁN JF, LEÓN LEAL A y MEDINA A.52
FIGURA 3. Cromatograma (IEC) representativo de los derivados aminoacídicos con ninhidrina de una muestra
de harina de lombriz.
FIGURE 3: Chromatogram (IEC) representing amino acid derivatives with ninhydrin of an earthworm sample.
a) Cromatograma obtenido a 570 nm.
b) cromatograma obtenido a 440 nm. Identificación: 1 2 = NI, 3 = Asp, 4 = Thr, 5 = Ser, 6 = Glu, 7 = Pro, 8 = Gly, 9 = Ala, 10
= Val, 11 = Met, 12 = NI, 13 = Ileu, 14 = Leu, 15 = Tyr, 16 = Phe, 17 19 = NI, 20 = His, 21 = NI, 22 = Lys, 23 = NI, 24 = Amoni aco,
25 = Arg. NI = No identificado.
a) Chromatogram obtained at 570 nm.
b) chromatogram obtained at 440 nm. Identification: 1 2 = NI, 3 = Asp, 4 = Thr, 5 = Ser, 6 = Glu, 7 = Pro, 8 = Gly, 9 = Ala, 10 um,
25 = Arg. NI = Not identified.
Ars Pharmaceutica, 44:1; 43 58, 2003

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