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MUTATIONS PONCTUELLES DES GENES TP53 ET KRAS DANS L'ADN PLASMATIQUE: SIGNIFICATION POUR LA DETECTION PRECOCE DES CANCERS ET POUR L'IDENTIFICATION D'INDIVIDUS A HAUT RISQUE D'EXPOSITIONS CANCERIGENES.

De
41 pages
Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Elodie CABOUX-DEREPIERRE Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes MUTATIONS PONCTUELLES DES GENES TP53 ET KRAS DANS L'ADN PLASMATIQUE: SIGNIFICATION POUR LA DETECTION PRECOCE DES CANCERS ET POUR L'IDENTIFICATION D'INDIVIDUS A HAUT RISQUE D'EXPOSITIONS CANCERIGENES. Soutenu le 18 novembre 2003 devant le jury suivant: Paldi Andras - Président Exbrayat Jean-Marie - Rapporteur Hainaut Pierre - Examinateur Gormally Emmanuelle - Examinateur Moyret-Lalle Caroline - Examinateur Laboratoire EPHE: Laboratoire de stage: Reproduction et Développement Cancérogenèse Moléculaire des Vertébrés Centre International de Recherche Faculté Catholique de LYON sur le Cancer 25, rue du Plat 150, cours Albert Thomas 69288 LYON Cedex 2 69378 LYON Cedex 8 Responsable: JM Exbrayat Responsable: P Hainaut ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE MUTATIONS PONCTUELLES DES GENES TP53 ET KRAS DANS L'ADN PLASMATIQUE: SIGNIFICATION POUR LA DETECTION PRECOCE DES CANCERS ET POUR L'IDENTIFICATION D'INDIVIDUS A HAUT RISQUE D'EXPOSITIONS CANCERIGENES. Elodie CABOUX-DEREPIERRE 18 novembre 2003 Le plasma/sérum de tous les individus contient de petites quantités d'ADN libre, vraisemblablement issu du relargage de matériel génétique par les tissus.

  • annexe annexe

  • mécanismes de mutagenèse et de carcinogenèse

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  • détection de mutation

  • cancer du foie

  • méthode de détection


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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences de la Vie et de la Terre   MEMOIRE   présenté   par   Elodie CABOUX-DEREPIERRE    Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes   MUTATIONS PONCTUELLES DES GENESTP53ETKRASDANS L’ADN PLASMATIQUE: SIGNIFICATION POUR LA DETECTION PRECOCE DES CANCERS ET POUR L’IDENTIFICATION D’INDIVIDUS A HAUT RISQUE D’EXPOSITIONS CANCERIGENES.  Soutenu le18 novembre 2003 devant le jury suivant: Paldi Andras - Président Exbrayat Jean-Marie - Rapporteur Hainaut Pierre - Examinateur Gormally Emmanuelle - Examinateur Moyret-Lalle Caroline - Examinateur  Laboratoire EPHE:                                                   Laboratoire de stage: Reproduction et Développement Cancérogenèse Moléculaire des Vertébrés Centre International de Recherche Faculté Catholique de LYON sur le Cancer 25, rue du Plat 150, cours Albert Thomas 69288 LYON Cedex 2 69378 LYON Cedex 8 Responsable: JM Exbrayat Responsable: P Hainaut jmexbrayat@univ-catholyon.fr                                           r.frcahai@tuani ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE  MUTATIONS PONCTUELLES DES GENESTP53ETKRASDANS L’ADN PLASMATIQUE: SIGNIFICATION POUR LA DETECTION PRECOCE DES CANCERS ET POUR L’IDENTIFICATION D’INDIVIDUS A HAUT RISQUE D’EXPOSITIONS CANCERIGENES.  Elodie CABOUX-DEREPIERRE  18 novembre 2003  Le plasma/sérum de tous les individus contient de petites quantités d’ADN libre, vraisemblablement issu du relargage de matériel génétique par les tissus. Chez les patients cancéreux, ces niveaux d’ADN
circulant sont souvent plus élevés et il est maintenant bien établi que des altérations génétiques caractéristiques du tissu cancéreux telles que des mutations ponctuelles, des pertes d’allèles, des hyperméthylations peuvent être détectées. Ces observations suggèrent que la recherche et le typage de l’ADN circulant pourrait constituer une approche intéressante pour la détection et le diagnostic précoce des cancers. Le but de ce projet est de déterminer si l’analyse de l’ADN circulant peut aider à repérer des patients à risque de cancer avant l’apparition de manifestations cliniques. En effet, si les méthodes actuelles permettent de détecter facilement l’ADN altéré dans le plasma des patients cancéreux, sa détection chez des individus normaux ou pré-cancéreux est beaucoup plus délicate étant donné les faibles niveaux d’ADN, souvent à peine supérieurs aux seuils de détection des méthodes couramment utilisées. Deux aspects sont donc développés au cours de ce projet: d'une part, la validation, sur le plan quantitatif, des méthodes de détections permettant de repérer de façon fiable de faibles niveaux d’ADN circulant. Pour cela une étude comparative de la sensibilité de différentes techniques de détection de mutations est réalisée; d'autre part, la recherche d’ADN altéré chez des individus témoins, pré-cancéreux ou cancéreux. Deux types d’altérations sont analysées: les mutations ponctuelles des gènesTP53 etKRAS études le cadre de deux dans épidémiologiques: une étude portant sur les cancers du foie (CHC) en Gambie dont la fréquence est très élevée en raison de l’endémie des infections par les virus des hépatites (VHB/VHC) et de la contamination alimentaire par une mycotoxine cancérigène pour le foie, l’aflatoxine, induisant des mutations du gèneTP53 au codon 249; et une étude portant sur les cancers liés au tabagisme passif et à la pollution atmosphérique en Europe basée sur des échantillons de sang de l’étude EPIC collectés chez 450 000 individus sains suivis depuis 15 ans dans 9 pays européens. Une analyse des mutations du gèneTP53 de la mutation au codon et 12 du gèneKRASva être menée sur des individus fumeurs ou ex-fumeurs depuis plus de 10 ans, témoins ou ayant développé un cancer du poumon, du larynx/pharynx, de la vessie, une leucémie ou une maladie pulmonaire chronique. Nous avons ainsi montré que les techniques de RFLP, SOMA et APEX sont très sensibles. Ensuite la recherche d'ADN altéré dans le cadre de l'étude en Gambie nous a permis de mettre en évidence un effet cumulé sur le risque de CHC résultant de l'infection chronique et de la réplication active du VHB et de l'effet mutagène de l'aflatoxine sur le codon 249 du gèneTP53. Enfin dans le cadre de l'étude européenne nous avons pu établir deux hypothèses. En effet il apparait que la présence de mutations au codon 12 du gèneKRAS et constitue donc un marqueur associée à la présence d'adduits de grande taille sur l'ADN est potentiel d'exposition à des agents cancérigènes, alors que la présence de mutations dans le gèneTP53 semble très corrélée avec le statut «cas» et pourrait donc constituer un marqueur du développement tumoral.  MOTS-CLES tabagisme passif -: cancer - ADN plasmatique - foie - Gambie - VHB/VHC - aflatoxine -pollution atmosphérique - Europe - mutations ponctuelles - gèneTP53- gèneKRAS.     LISTE DES ABREVIATIONS  LISTE DES FIGURES  LISTE DES TABLEAUX  INTRODUCTION:  I-              MUTATIONS ET CANCERS 2  I-1- Qu'est-ce que le cancer?                                                                           3 I-2- Classification                                                                                           4 I-3- Caractéristiques des cellules cancéreuses                                     5 I-4- Des mutations à l’origine du cancer                                                         7  II-            DEUX GENES SOUVENT MUTES DANS LES CANCERS HUMAINS:
TABLE DES MATIERES
TP53ETKRAS 10   II-1- Le gèneTP53                                                                                          10  II-1-1- Définition                                                                                10  II-1-2- Structure                                                                                  11  II-1-3- Activation                                                                               12                        II-1-4- Conséquences de l’activation de la protéine p53                    13  II-1-5- Mutations dans les cancers                                                     14  II-2- Le gèneKRAS                                                                                         16  II-2-1- Définition                                                                                16 II-2-2- Structure                                                                                  17                          II-2-3- Activation et régulation                                                           17  II-2-4- Mutations dans les cancers                                                     18       III-          L’ADN PLASMATIQUE: UNE SOURCE DE BIOMARQUEURS DANS LES CANCERS 20  III-1- Caractéristiques et origine                                                                     20 III-2- Méthodes d’analyse                                                                              21 III-3- ADN circulant et pathologies cancéreuses                                            22 III-4- Utilisation de l'ADN circulant                                                              23  IV-          INTERACTIONS GENES-ENVIRONNEMENT ET CANCEROGENESES24   IV-1- Les cancers du foie                                                                              24  IV-1-1- Epidémiologie descriptive                                                      25  IV-1-2- Facteurs de risque                                  26                                  IV-1-2-1- Les virus des hépatites                                           26  IV-1-2-2- Les aflatoxines                                                        27 IV-1-2-3- Autres facteurs                                                       28                                       IV-1-3- Pathologie moléculaire                                                           29  IV-1-4- Mécanismes de mutagenèse et de carcinogenèse                    29             IV-1-5- Etude en Gambie (GHIS: Gambia Hepatitis          tervention Study)                                                               31 In IV-2- Les cancers liés au tabagisme passif et à la pollution atmosphérique   32 IV-2-1- e cancer du poumon                                                            32 L  IV-2 - Définition et classification                                      32 -1-1  IV-2-1-2- Epidémiologie descriptive                                      33 IV-2-2- Les autres types de cancers impliqués                                  33 IV-2-3- Les facteurs de risque                                                34  IV-2-3-1- Le tabagisme actif et passif                        34  IV-2-3-2- La pollution atmosphérique                                   35 IV-2-4- Mécanismes de carcinogenèse et de mutagenèse                    36 IV-2-5- Etude GENAIR (GENetic susceptibility in relation to AIR pollution and Environmental Tobacco Smoke)                      38
             OBJECTIFS DU TRAVAIL                                                           39  Les objectifs de ce travail sont -       d’améliorer la détection des mutations dans l’ADN plasmatique en comparant les seuils de sensibilité des différentes méthodes disponibles -       d’étudier la signification diagnostique ou pronostique des mutations dans l’ADN plasmatique dans le contexte d’études cas-témoins ou d’études prospectives.  MATERIELS ET METHODES  I-              LE CONTEXTE DES ETUDES ET LE MATERIEL UTILISE 41  I-1- Comparaison entre différentes techniques de détection de mutations     41 I-1-1- Les lignées cellulaires                                                                41 I-1-2- Les gammes de dilutions                                                           42 I-2- L'étude GHIS                                                                                           42 I-2-1- Etude cas/témoins en Gambie                                                   43 I-2-2- L'analyse des échantillons                                                        43 I-3- L'étude GENAIR                                                                                     43 I-3-1- Etude cas/témoins                                                                     44 I-3-2- Les différentes analyses                                                           44  II-            LES METHODES UTILISEES 45  II-1- Purification et caractérisation de l'ADN plasmatique                            45 II-1-1- Extraction d'ADN                                                                   45 II-1-2- Quantification de l'ADN plasmatique                                    45 II-2- Détection de mutations                                                                          46  II-2-1- Lignées cellulaires utilisées comme témoins positifs              46  II-2-2- Amplification de l'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction)                                      46        II-2-3- TTGE (Temporal Temperature Gradient Electrophoresis)    47  II-2-4- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)            48  II-2-5- ME-PCR (Mutant-Enriched PCR)                                         49 II-2-6- DHPLC (Denaturating High Liquid Performance Chromatography)                                                                           51      II-2-7- Séquençage direct                                                                    52  II-2 8 APEX (Arrayed Primer EXtension)                                       52 - - II-2-9- SOMA (Short Oligonucleotides Mass Analysis)                   54
   RESULTATS  I-              DETECTION DE MUTATIONS DANS L’ADN PLASMATIQUE: COMPARAISON ENTRE DIFFERENTES METHODES 56 I-1- Comparaison de méthodes de pré-screnning de la mutation ser249        57 I-2- Comparaison de méthodes de séquençage de la mutation ser249            58
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