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THÈSE Présentée par Cédric FIEZ VANDAL Pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Mention Sciences de la Vie et de la Santé Spécialité Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie Vers l'Étude Structurale des Récepteurs Couplés aux Protéines G Towards Structural Studies on G Protein Coupled Receptors Soutenue publiquement le avril au Collège Doctoral Européen des Universités de Strasbourg Devant les membres du jury Dr Franc PATTUS Directeur de thèse Prof So IWATA Co directeur de thèse Prof Marcel HIBERT Rapporteur interne Prof Eva PEBAY PEYROULA Rapporteur externe Prof Andreas ENGEL Rapporteur externe Dr Niek DEKKER Examinateur

De
164 pages
Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THÈSE Présentée par Cédric FIEZ-VANDAL Pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur – Strasbourg I Mention : Sciences de la Vie et de la Santé Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie Vers l'Étude Structurale des Récepteurs Couplés aux Protéines G (Towards Structural Studies on G Protein-Coupled Receptors) Soutenue publiquement le 18 avril 2008 au Collège Doctoral Européen des Universités de Strasbourg Devant les membres du jury : Dr. Franc PATTUS Directeur de thèse Prof. So IWATA Co-directeur de thèse Prof. Marcel HIBERT Rapporteur interne Prof. Eva PEBAY-PEYROULA Rapporteur externe Prof. Andreas ENGEL Rapporteur externe Dr. Niek DEKKER Examinateur

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THÈSE Présentée par Cédric FIEZ-VANDAL Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur – Strasbourg I Mention : Sciences de la Vie et de la Santé Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la BiologieVers l’Étude Structurale des Récepteurs Couplés aux Protéines G (Towards Structural Studies on G Protein-Coupled Receptors)Soutenue publiquement le 18 avril 2008 au Collège Doctoral Européen des Universités de Strasbourg Devant les membres du jury : Dr. Franc PATTUS Directeur de thèse Prof. So IWATA Co-directeur de thèse Prof. Marcel HIBERT Rapporteur interne Prof. Eva PEBAY-PEYROULA Rapporteur externe Prof. Andreas ENGEL Rapporteur externe Dr. Niek DEKKER Examinateur
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À Jan
“Mr. Fiez-Vandal was a member of the European Doctoral College of the University of Strasbourg during the preparation of his Ph.D., from 2005 to 2008, René Cassin year class 2005-2006. During his three-year membership, he benefited from specific financial supports offered by the College and, along with his mainstream research, was able to follow a special course offered by the College, concerning topics of general European interests presented by a few renowned international experts. This Ph.D. research project has been led with the collaboration of two universities: Imperial College London and the Louis Pasteur University in Strasbourg.” Dr. Jur. Michael Vorbeck (former Head of Higher Education and Research at the Council of Europe)
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Contents
ABSTRACT ...................................................................................................................................................................7RÉSUMÉ ........................................................................................................................................................................9FOREWORD: THE MAGNIFICENT SEVEN .................................................................................................... 13CHAPTER 1: GENERAL INTRODUCTION TO GPCRs................................................................................. 171.1STRUCTURE.................................................................................................................................................... 181.2FUNCTION....................................................................................................................................................... 181.3GPCRLOCALIZATION&OLIGOMERIZATION............................................................................................... 211.4GPCRCONSTITUTIVE ACTIVITY AND INVERSE AGONISM............................................................................ 231.5FIRST STRUCTURES OF7TMRECEPTORS...................................................................................................... 241.6FIRST STRUCTURE OF A RECOMBINANTGPCR:THE HUMANβ2-ADRENORECEPTOR.................................. 271.7ACTIVATION MECHANISM............................................................................................................................. 291.8GPCRDRUG DISCOVERY............................................................................................................................... 311.9CHALLENGES OF WORKING WITH MEMBRANE PROTEINS............................................................................. 341.9.1Recombinant expression systems ......................................................................................................... 341.9.2Pichia pastoris ...................................................................................................................................... 351.9.3......................................................................................................... 36Crystallizing membrane proteins 1.10MEPNET INITIATIVE.................................................................................................................................... 421.10.1Human dopamine receptors ............................................................................................................... 421.10.2Humanα2-adrenoreceptors ............................................................................................................... 441.10.3Human adenosine A2(A)receptors ...................................................................................................... 461.10.4........................................................................................................... 47Human cannabinoid receptors 1.10.5..................................................................................................................... 49Human opioid receptors 1.10.6Human tachykinin receptors .............................................................................................................. 50CHAPTER 2: AIMS AND SCOPES OF THIS THESIS ..................................................................................... 53CHAPTER 3: MATERIALS & METHODS ......................................................................................................... 553.1MATERIALS.................................................................................................................................................... 553.2MOLECULARBIOLOGY.................................................................................................................................. 553.2.1DNAs and expression vectors............................................................................................................... 553.2.2Manipulating DNA (modification, amplification and purification) .................................................. 563.2.3Cloning of the pPICZG-Gαvectors, pPIC9KF-GPCR:Gαand pPIC9K-OmpA:GPCR................. 563.2.4Transforming yeast strain SMD1163................................................................................................... 573.2.4.1 Preparing yeast competent cells...........................................................................................................................573.2.4.2 Preparing DNA .....................................................................................................................................................583.2.4.3 Yeast electroporation............................................................................................................................................583.2.4.5 Small-scale expression screening ........................................................................................................................583.3YEAST CULTURE(SHAKE FLASK&BIOREACTOR)........................................................................................ 593.4MEMBRANE PREPARATION............................................................................................................................ 593.5CHOLESTEROL ENRICHMENT OF MEMBRANES.............................................................................................. 593.6IN VITROBIOTINYLATION............................................................................................................................... 593.7COLORIMETRIC MEASUREMENT OF PROTEIN CONCENTRATION................................................................... 593.8SDS-PAGE, WESTERN-BLOTTING AND IMMUNODETECTION..................................................................... 603.9DOT-BLOT IMMUNODETECTION..................................................................................................................... 603.10RADIOLIGAND BINDING ASSAYSMEMBRANE-BOUND&PURIFIED RECEPTORS..................................... 6035 3.11[ S]GTPγSBINDING ASSAYS..................................................................................................................... 613.12PURIFICATION.............................................................................................................................................. 61
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3.12.1Solubilization....................................................................................................................................... 613.12.2Immobilized metal affinity chromatography ..................................................................................... 613.12.3Immobilized monomeric avidin affinity chromatography ................................................................ 623.12.4Anti-FLAG M2 affinity chromatography (batch).............................................................................. 623.12.5Purification of streptavidin and TEV protease ................................................................................. 623.12.6Preparation of streptavidin-coated agarose beads .......................................................................... 623.12.7Streptavidin-based affinity chromatography..................................................................................... 633.12.8Deglycosylation................................................................................................................................... 633.12.9Size exclusion chromatography ......................................................................................................... 633.13DYNAMIC LIGHT SCATTERING..................................................................................................................... 633.14ELECTRONIC MICROSCOPY.......................................................................................................................... 633.15MALDI-TOFMASS SPECTROMETRY.......................................................................................................... 633.16THREE-DIMENSIONAL CRYSTALLIZATION TRIALS...................................................................................... 64CHAPTER 4: LARGE-SCALE EXPRESSION OF GPCRs .............................................................................. 65LARGE-SCALEEXPRESSION OFFUNCTIONALHUMANDOPAMINED2RECEPTOR INPICHIA PASTORISBIOREACTORCULTURES.......................................................................................................................................... 65CHAPTER 5: PRODUCTION & PURIFICATION OF GPCRs....................................................................... 775.1PRODUCTION& PURIFICATION TRIALS ONDRD2, ADA2BANDAA2AR ................................................ 775.1.1Expression construct............................................................................................................................. 775.1.2.................................................................................................. 78Production of recombinant receptors 5.1.2.1Western-blot analysis.......................................................................................................................................785.1.2.2Radioligand binding assays .............................................................................................................................785.1.3Purification of DRD2............................................................................................................................ 795.1.3.1Purification of DRD2 – immobilized metal affinity chromatography..........................................................795.1.3.2Purification of DRD2 – immobilized monomeric avidin chromatography..................................................805.1.3.3Purification of DRD2 – M2 anti-FLAG antibody matrix..............................................................................815.1.3.4Purification of DRD2 – streptavidin-based affinity chromatography ..........................................................815.1.3.5Purification of DRD2 – deglycosylation ........................................................................................................825.1.3.6Purification of DRD2 – dialysis removal of TEV protease...........................................................................825.1.4Purification of ADA2B.......................................................................................................................... 835.1.4.1Purification of ADA2B – streptavidin-based affinity chromatography .......................................................835.1.4.2Purification of ADA2B – dialysis removal of TEV protease........................................................................835.1.4.3Purification of ADA2B – size exclusion chromatography............................................................................845.1.5Purification of AA2AR .......................................................................................................................... 855.1.5.1Purification of AA2AR – streptavidin-based affinity chromatography .......................................................855.1.5.2Purification of AA2AR – size exclusion chromatography............................................................................855.2PURIFICATION OF SEVERAL OTHERGPCRS FROM THEMEPNET COLLECTION.......................................... 865.3DYNAMIC LIGHT SCATTERING AND ELECTRONIC MICROSCOPY EXPERIMENTS........................................... 865.4THREE-DIMENSIONAL CRYSTALLIZATION TRIALS OFDRD2, ADA2B, AA2ARANDCNR2.................... 865.5DISCUSSION& FUTURE WORK...................................................................................................................... 87CHAPTER 6: GPCR–GαFUSION PROTEINS ................................................................................................ 1096.1INTRODUCTION............................................................................................................................................ 1096.2RESULTS& DISCUSSION.............................................................................................................................. 110CHAPTER 7: OmpA–GPCR FUSION PROTEINS .......................................................................................... 1297.1INTRODUCTION............................................................................................................................................ 1297.2RESULTS& DISCUSSION.............................................................................................................................. 131CHAPTER 8: SUMMARY AND OUTLOOK .................................................................................................... 133REFERENCES ......................................................................................................................................................... 135ABBREVIATIONS .................................................................................................................................................. 157ACKNOWLEDGMENTS....................................................................................................................................... 159CURRICULUM VITÆ ........................................................................................................................................... 161
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Abstract
G protein-coupled receptors (GPCRs) mediate the majority of cellular responses to hormones and neurotransmitters. Consequently, they constitute the largest family of pharmaceutical targets. Efforts in applying structure-based drug design andin silicoscreening to facilitate drug discovery for this important class of molecules is limited by the lack of high-resolution structural information. Indeed, Bovine rhodopsin and the human 1-3 β2-adrenoreceptor are the only GPCRs for which a high-resolution structure is available . Here, we report progress made in expressing and purifying mammalian GPCRs from the MePNet collection in the methylotrophicPichia pastorisyeast expression system. Beginning initially with flask cultures and subsequently with medium cell density fermentor cultures, GPCRs, expressed with N-terminal FLAG epitope and decahistidine, and C-terminal biotinylation fusion tags, were subjected to various purification methods. The use of home-made streptavidine-coated beads in batch gave the most success in purifying these GPCRs. After having checked their oligomerization state by size exclusion chromatograhy, dynamic light scattering and electronic microscopy, three-dimensional crystallization trials were conducted by using the sitting-drop technique. Other approaches included generating fusion proteins to enhance expression and stability, and to increase the amount of hydrophilic surface area. In particular, functional fusions with G proteins yielded promising results. In order to increase the likelihood of crystal formation, we also fused the well-know and highly stableβ-barrel protein OmpA, to the N-terminal end of some GPCRs. Preliminary expression results with such latter fusions encourage us to go further in this direction.
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Résumé
La famille des Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) est caractérisée par la présence de sept domaines transmembranaires (« seven transmembrane receptors » ou 7TM en anglais). Ces récepteurs contrôlent l'activité physiologique de la majorité des cellules et sont la cible privilégiée de la plupart des drogues et de plus de 50 % des médicaments connus. L'étude de cette famille de récepteurs présente donc un intérêt scientifique majeur. L'enjeu économique est énorme puisque l'exploitation des RCPG ouvre la porte à la découverte et au développement de composés actifs sur la plupart des pathologies humaines. La taille du marché visé représente à terme plusieurs centaines de milliards d'euros. La concurrence est très significative et la plupart des grosses sociétés pharmaceutiques ont mis en place des programmes de criblage à haut débit ciblant exclusivement ces récepteurs. Mais elles manquent encore de données structurales leurs permettant d’améliorer ces projets de « drug discovery ». En effet, seules deux structures tridimensionnelles de RCPG ont été 1 résolues jusqu'à présent, celle de la rhodopsine bovine , et très récemment, celle du récepteur 2-4 β2. Si ces deux structures apportent des informations précieuses, elles-adrenergique humain restent néanmoins insuffisantes. De nombreux consortiums se sont donc mis en place ces dernières années pour lever les écueils propres à l’expression, la production et la cristallisation de ces récepteurs membranaires. Ce travail de thèse s’inscrit ainsi dans le programme MePNet (Membrane Protein 5 Network,http://www.mepnet.org/) réunissant plus d’une demi-douzaine de grands groupes pharmaceutiques (Abbott, AstraZeneca, Daiichi-Sankyo, GlaxoSmithKline, Kyowa, Novartis, Pfizer, Sanofi Aventis). Son objectif est de mettre en place des stratégies de production pour les RCPG en utilisant le système d’expressionPichia pastoris. La première partie de ce travail a été consacrée au récepteur à la dopamine de type D2(D2DR humain), une cible thérapeutique majeure dans le traitement des addictions, de la maladie de Parkinson et de la schizophrénie. Des expériences de fermentation utilisant la levurePichia pastoris et visant à produire en grande quantité ce récepteur ont été menées
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avec succès. La quantité de récepteur produit a été évaluée qualitativement (tests de fixation de ligands à l’équilibre) et par Western-blots. L’effet de différents paramètres sur l’expression du récepteur en fermenteur (diminution de la température d’induction, présence ou non de chaperons chimiques et pharmacologiques) a également été abordé. Les résultats obtenus en fermenteur dans des conditions optimisées d’expression se sont révélés être du même niveau que ceux obtenus en fiole. Ces résultats très encourageants nous ont permis de transposer avec succès l’expression du D2DR humain dans de grandes unités de fermentation. Une collaboration avec le Prof. Philip G. Strange (University of Reading, School of Pharmacy, Royaume-Uni) a été amorcée pour caractériser plus finement d’un point de vue pharmacologique (mesures de Bmax) ce récepteur produit sous forme recombinante. De nombreux essais de purification, combinant plusieurs types de résines (SP Sepharose Fast Flow, IMAC resins, avidin agarose resin, anti-FLAG M2 affinity gel, entre autres), en batch ou en colonne, n’ont malheureusement permis de ne récupérer qu’une
très faible fraction du récepteur exprimé. C’est pourquoi, dans la seconde partie de cette étude, nous avons développé et ensuite appliqué à de nombreux autres récepteurs une technique de purification en une étape. Cette technique est basée sur l’affinité de l’extrémité C-terminale biotinylée des récepteurs pour des billes couplées à la streptavidine. Le récepteur à la dopamine de type D2, le récepteur α2B-adrénergique (α2BAR humain), le récepteur aux cannabinoïdes de type 2 (CB2R humain), le récepteur aux opioïdes de typeκ (κOR humain), le récepteur à la neurokinine de type 3 (NK3R humain), le récepteur du neuropeptide Y1 (NPY1R humain) et le récepteur A2A de l’adénosine (A2AR humain) ont ainsi été purifiés et soumis à des essais de cristallogenèse. Pour certains d’entre eux, des expériences de gel filtration, de microscopie électronique ou de diffusion dynamique de la lumière ont permis d’apprécier leur degré d’oligomérisation. Nous avons également cherché à stabiliser certains de ces récepteurs en les fusionnant ou en les co-exprimant avec la sous-unité Gαde leur protéine G. Le récepteur à la dopamine de type D2, le récepteur à la neurokinine de type 2 (NK2R murin) et le récepteur A2A de l’adénosine ont ainsi été respectivement fusionnés, à leur extrémité C-terminale, avec la sous-unité GαοΑ, la sous-unité Gαq, et la version courte ou longue de la sous-unité Gαs. Dans le cadre de notre collaboration avec le Prof. Philip G. Strange, nous avons utilisé un analogue 35 non hydrolysable du GTP ([ S]GTPγS) pour évaluer l’effet de différents agonistes ou antagonistes sur les fusions D2DR:GαοΑA et 2AR:Gαs. Ces diverses constructions, si elles se
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