Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

Sandro Roselli

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
1 UNIVERSITE DE STRASBOURG Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé THESE présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université de Strasbourg Discipline : Sciences du Vivant Domaine : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie par Sandro ROSELLI GENOMIQUE FONCTIONNELLE DE LA DEGRADATION MICROBIENNE DU CHLOROMETHANE Soutenue publiquement le 15 décembre 2009 devant la commission d'examen : Pr. Jean-Charles PORTAIS Examinateur Pr. Laurence SABATIER Rapporteure interne Dr. Hendrik SCHÄFER Rapporteur externe Pr. Julia VORHOLT Rapporteure externe Dr. Françoise BRINGEL Co-directrice de thèse Pr. Stéphane VUILLEUMIER Co-directeur de thèse

• dégradation de l'ozone stratosphérique


• chloromethane- grown cells


• gènes cmu


• inventaire des sources et des puits du chlorométhane dans l'estimation du budget global du chlorométhane


• cm4


• analyse différentielle du protéome de la souche cm4 cultivée sur le chlorométhane


• budget


• global chloromethane


• chlorométhane


• chloromethane- degrading strains

Sujets

• Sabatier
• Schäfer
• Roselli
• Université de Strasbourg

Informations

• Publié par: profil-feym-2012
• Publié le: 01 décembre 2009
• Nombre de lectures: 74
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

UNIVERSITE DE STRASBOURG

Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé


THESE

présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Strasbourg
Discipline : Sciences du Vivant
Domaine : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
par
Sandro ROSELLI


GENOMIQUE FONCTIONNELLE DE LA DEGRADATION
MICROBIENNE DU CHLOROMETHANE



Soutenue publiquement le 15 décembre 2009 devant la commission d’examen :

Pr. Jean-Charles PORTAIS Examinateur
Pr. Laurence SABATIER Rapporteure interne
Dr. Hendrik SCHÄFER Rapporteur externe
Pr. Julia VORHOLT Rapporteure externe
Dr. Françoise BRINGEL Co-directrice de thèse
Pr. Stéphane VUILLEUMIER Co-directeur de thèse
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2 Résumé

Le chlorométhane est un composé organique volatile, majoritairement d’origine naturelle.
Il est notamment produit par les plantes, les algues et les champignons, les marais salants
ou par combustion de biomasse. C’est l’halocarbone le plus abondant de l’atmosphère, responsable
à lui seul de plus de 15% de la dégradation de l’ozone stratosphérique causée par les composés
halogénés. L’inventaire des sources et des puits du chlorométhane dans l’estimation du budget global
du chlorométhane est encore incertain, et sous-estime potentiellement l’importance des émissions
végétales de ce composé et sa dégradation par les microorganismes.
L’objectif de ce projet de thèse a été de développer la compréhension des bases moléculaires
de la dégradation bactérienne du chlorométhane dans une perspective de valorisation des ressources
génétiques de l’environnement et de l’utilisation de ces connaissances pour la dépollution de sites
contaminés. C’est dans la bactérie méthylotrophe chlorométhane-dégradante Methylobacterium
extorquens CM4 qu’avaient été précédemment identifiés les gènes cmu de dégradation aérobie
du chlorométhane, la caractérisation in vitro de l’activité de déchloration correspondante
par les protéines CmuA et CmuB, ainsi que la voie correspondante d’utilisation du chlorométhane
pour la croissance bactérienne. Dans le contexte de la souche CM4, dont le génome a été séquencé
au cours de ce travail, une approche combinant génomique comparative et fonctionnelle
a été développée pour une étude approfondie de l’adaptation de bactéries méthylotrophes du genre
Methylobacterium à la croissance sur chlorométhane comme seule source de carbone et d’énergie.
L’analyse du génome de la souche CM4 et la comparaison avec d’autres souches M. extorquens
a révélé l’existence chez CM4 d’un plasmide spécifique de 380 kb, porteur des gènes connus
pour leur implication dans l’utilisation du chlorométhane, de paralogues de gènes de biosynthèse
et de transport de la cobalamine, ou liés au métabolisme du tétrahydrofolate, cofacteurs
tous deux essentiels à l’utilisation microbienne du chlorométhane par la voie cmu. Il reste à évaluer
si ce plasmide est capable de conférer seul à une bactérie la capacité de croître sur le chlorométhane.
L’analyse différentielle du protéome de la souche CM4 cultivée sur le chlorométhane ou
sur le méthanol a permis de confirmer la voie d’utilisation précédemment proposée, et d’identifier de
nouvelles protéines vraisemblablement associées au métabolisme du chlorométhane par cette souche,
dont les gènes ont d’ailleurs pour partie été retrouvés associés aux gènes cmu chez d’autres bactéries
chlorométhane-dégradantes. En revanche, l’expression du gène cmuC, essentiel pour la croissance
avec le chlorométhane chez CM4 mais de fonction inconnue, n’a pas été détectée au niveau protéique.
Un autre volet de ce travail a consisté en l’étude de la diversité des bactéries chlorométhane-
dégradantes associées à la phyllosphère. Trois souches ont été isolées à partir de cultures
d’enrichissement réalisées à partir de feuilles d’Arabidopsis thaliana, une plante-modèle connue pour
émettre du chlorométhane, et représentent à notre connaissance les premières souches chlorométhane-
dégradantes obtenues de la phyllosphère. Le potentiel de dégradation du chlorométhane de ces souches
a été évalué par des mesures de l’activité de déchloration du chlorométhane. Par une approche de PCR
et de séquençage, l’organisation des gènes cmu des bactéries chlorométhane-dégradantes
nouvellement isolées dans ce travail ainsi que celles décrites précédemment ont été comparées,
confirmant l’organisation unique à ce jour des gènes cmu du plasmide p1MCHL de la souche CM4.
Les résultats obtenus dans ce travail serviront de base aux études de génomique comparative
et fonctionnelle à venir sur l’utilisation du chlorométhane chez la souche de référence
Methylobacterium extorquens CM4 et chez d’autres bactéries utilisant le chlorométhane pour leur
croissance.
Mots clés : Bactéries méthylotrophes, chlorométhane, génomique fonctionnelle, gènes cmu,
cobalamine, phyllosphère
3 Abstract

Chloromethane is a volatile organic compound, mainly of natural origin - plants, algae, wood-rotting
fungi, salt marshes and burning biomass all produce chloromethane. It is the most abundant
halocarbon in the atmosphere, and accounts for at least 15% of chlorine-catalysed ozone depletion.
At present, it is difficult to evaluate the global chloromethane budget, as the inventory
of chloromethane sources and sinks suffers from poor estimates of plant emissions and microbial
degradation for this compound.
The aim of this PhD thesis was to better understand the molecular basis of chloromethane microbial
degradation and contribute to develop the use of microbial genetic resources of interest
from the environment in the perspective of the bioremediation of contaminated environments.
The cmu (chloromethane utilisation) genes for aerobic degradation of chloromethane were previously
identified and characterised in Methylobacterium extorquens CM4, the corresponding dehalogenation
activity was characterised in vitro using purified CmuA and CmuB proteins, and a metabolic pathway
for the use of chloromethane for growth was defined. In this study, the genome sequence of strain
CM4 was obtained and analysed, and chloromethane utilisation by methylotrophic bacteria
of the genus Methylobacterium was further investigated using comparative genomics and functional
genomic approaches.
Comparative analysis of the genome of different M. extorquens strains revealed the presence
of a unique 380 kb plasmid p1MCHL in strain CM4 which harbours the known genes
for chloromethane utilization, as well as both orphan and duplicated genes involved in the biosynthesis,
transport, and metabolism of cobalamin and tetrahydrofolate, the two essential cofactors
for chloromethane utilization by the cmu pathway. Whether the p1MCHL plasmid alone may confer
the ability to grow with chloromethane remains to be investigated.
The proteomes from chloromethane- and methanol-grown cultures further confirmed the proposed
cmu pathway for chloromethane utilisation. Some of the 33 proteins more abundant in chloromethane-
grown cells were encoded by genes associated with the cmu gene cluster found in other
chloromethane-degrading bacteria. However, expression at the protein level of cmuC, a gene
of unknown function essential for growth of strain CM4 with chloromethane, was not detected.
In addition, the diversity of chloromethane-degrading bacteria associated with the phyllosphere
was investigated by a cultural approach. Leaves of Arabidospis thaliana, known to emit
chloromethane, were used as inocula to obtain liquid cultures growing with chloromethane as the sole
carbon and energy source. Three Hyphomicrobium strains, possibly the first chloromethane-degrading
strains isolated from the phyllosphere, were obtained, and their specific activity for chloromethane
dehalogenation was determined. Using newly designed PCR primers, the cmu genes of these isolates
were sequenced, and their organisation was compared to that of previously reported chloromethane-
degrading strains. The cmu gene clusters of the new isolates differ from that found on the p1MCHL
plasmid of strain CM4.
The results obtained in this work w