Mise en place d'une plateforme de criblage d'anticorps recombinants sous la forme de scFv par la méthode de « phage display ».

Lucie Crépin

Description

Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Lucie Crépin Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Mise en place d'une plateforme de criblage d'anticorps recombinants sous la forme de scFv par la méthode de « phage display ». Soutenu le 22 septembre 2006 devant le jury suivant : Monsieur Andràs Paldi Président Monsieur Claude Granier Examinateur extérieur Monsieur Xavier Ronot Examinateur Monsieur Jérôme Garin Examinateur Monsieur Alain Dupuis Examinateur Laboratoire de Dynamique Cellulaire Directeur : Xavier RONOT Ecole Pratique des Hautes Etudes CNRS UMR 5525 38 706 La Tronche cedex Laboratoire de Chimie des Protéines Directeur : Jérôme GARIN ERM0201 INSERM/UJF/CEA DRDC/CP CEA-GRENOBLE 17, rue des Martyrs 38054 Grenoble cedex 09 RESUME EPHE Banque de Monographies SVT 1

• méthode


• protéine


• sélection d'anticorps recombinants


• peptide


• criblage


• caractérisation secondaire des clones


• elimination des clones identiques par séquençage


• banques immunes


• scfv

Sujets

• Dupuis
• Andras
• Crépin
• Granier
• Institut national de la santé et de la recherche médicale
• Méthode
• Protéine

Informations

• Publié par: chaeh
• Publié le: 01 septembre 2006
• Nombre de lectures: 97
• Langue: Français

Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET
DE LA RECHERCHE





ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Science de la Vie et de la Terre

MEMOIRE

Présenté par
Lucie Crépin

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes


Mise en place d’une plateforme de criblage
d’anticorps recombinants sous la forme de scFv
par la méthode de « phage display ».



Soutenu le 22 septembre 2006 devant le jury suivant :

Monsieur Andràs Paldi Président Claude Granier Examinateur extérieur
Monsieur Xavier Ronot Examinateur Jérôme Garin
Monsieur Alain Dupuis



Laboratoire de Dynamique Cellulaire Directeur : Xavier RONOT
Ecole Pratique des Hautes Etudes
CNRS UMR 5525
38 706 La Tronche cedex
[e-mail]

Laboratoire de Chimie des Protéines Directeur : Jérôme GARIN
ERM0201 INSERM/UJF/CEA
DRDC/CP CEA-GRENOBLE
17, rue des Martyrs
38054 Grenoble cedex 09
[e-mail]
RESUME

EPHE Banque de Monographies SVT 1La présentation à la surface d’un bactériophage, « phage display » est devenu un outil très puissant
pour la sélection d’anticorps recombinants (scFv). Cette technique permet d’obtenir des scFv
(équivalents à des anticorps monoclonaux) sans nécessiter l’immunisation d’un animal. Les scFv
obtenus sont disponibles en quantité illimitée, et ils peuvent servir de base pour la construction de
protéines chimériques par biologie moléculaire pour de nombreuses applications. Cette technique a
été mise en place au laboratoire et nous l’avons validé en recherchant des scFv contre différents
échantillons d’intérêts.

Le criblage des banques Tomlinson I et J contre la protéine P76, sous forme de protéine recombinante
surexprimée par une bactérie (P76-Flag), nous a permis de sélectionner 3 scFv. En Western Blot, ces
scFv détectent spécifiquement la protéine P76-Flag et le précurseur de P76 dans le surnageant de
culture de cellules qui la surexpriment (HEK-293 P76).

Nous avons par ailleurs robotisé la première analyse des clones issus du criblage ce qui permet de
caractériser 4608 clones producteurs de scFv en parallèle. En utilisant cette technique, un criblage a
été effectué contre un mélange de sept peptides synthétiques correspondant à la partie C-terminale de
protéines majeures de la membrane des compartiments de la voie endocytaire. Ce criblage nous a
permis d’obtenir 4 scFv spécifiques en ELISA (« Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ») du
peptide correspondant au récepteur du mannose-6-phosphate indépendant des cations (CI-MPR). En
Western Blot ces scFv ne sont pas spécifiques du CI-MPR. Néanmoins, leur marquage en
Immunofluorescence suggère qu’ils pourraient être spécifiques d’un signal d’adressage des protéines
de la voie endocytaire. Nous avons aussi obtenus 4 scFv spécifiques en ELISA du peptide
correspondant à l’isoforme 1 de la protéine Lamp2.

Au-delà de la validation de la méthode, les criblages effectués nous ont permis de développer et
d’optimiser différentes techniques de caractérisation des scFv. Nous avons notamment mis au point
une technique de discrimination des scFv en fonction de leur carte peptidique grâce à une analyse de
spectrométrie de masse. Maintenant robotisée, cette technique permet d’effectuer des caractérisations
à haut débit de clones producteurs de scFv en aval des étapes de criblage.

MOTS CLÉS : phage display, scFv, voie endocytaire, spectrométrie de masse, robotisation.

ABLE DES MATIERES …………………………………………………………………… - 1 -
STE DES FIGURES ET TABLEAUX……………………………………………………… - 4 -
STE DES ABRÉVIATIONS………………………………………………………………… - 5 -
TRODUCTION……………………………………………………………………………… - 7 -

A. LE PHAGE DISPLAY.......................................................................................................... 6
I. Différents types de présentation.............................................................................. 7
1. modèles...................................................................... 7
1.1. Présentation à la surface de cellules (« cell display »)........................................ 7
1.1.a. à la surface de bactéries (« Bactery display »).......................... 8
1.1.b. Présentation à la de levures (« Yeast display »)............................... 9
1.2. en lien avec les ribosomes et l’ARNm.......................................... 9
1.3. La présentation à la surface d’un bactériophage (« phage display »)............... 10
2. Caractéristique du phage M13........................................................................... 12
2.1. Structure du phage M13.................................................................................. 12
2.2. Cycle M13....................................................................................... 12
2.3. Protéines utilisées pour l’expression de banques............................................. 13
3. Application du phage display............................................................................. 14
3.1. Peptides........................................................................................................... 14
EPHE Banque de Monographies SVT 23.2. Enzymes.......................................................................................................... 15
3.3. Anticorps......................................................................................................... 15
II. Anticorps recombinants......................................................................................... 16
1. Les différents formats possibles......................................................................... 16
2. types de banques de scFv............................................................ 17
2.1. Banques immunes........................................................................................... 17
2.2. naïves................................................................................................ 18
2.3. Banques semi-synthétiques............................................................................. 18
3. Intérêt et application des anticorps recombinants de type scFv (isolés par phage
display) 18
3.1. Application pour la biologie moléculaire......................................................... 18
3.2. dans le domaine biomédical.......................................................... 19
3.2.a. Agents neutralisants.................................................................................... 19
3.2.b. Anticorps anti-idiotype............................................................................... 19
3.2.c. intracellulaires anticancers20
3.2.d. La société CAT, « Cambridge Antibodies Technology »........................... 21
B. COMPARTIMENTS ASSOCIES A LA VOIE ENDOCTAIRE................................... 21
I. Les différentes entrées de matériel dans la cellule................................................ 21
II. Les compartiments de la voie endocytaire............................................................ 22
1. Les endosomes précoces...................................................................................... 22
2. tardifs......................................................................................... 22
3. Les lysosomes....................................................................................................... 23

BJECTIFS…………………………………………………………………………………... - 29 -
ATERIEL ET METHODE…………………...…………………………………………… - 30 -

A. CARACTERISTIQUES DES BANQUES TOMLINSON I ET J
B. UTILISATION DES BANQUES TOMLINSON I ET J....................................................
I. Préparation des banques............................................................................................
1. Production du phage helper KM13........................................................................
2. Purification du helper, précipitation PEG..................................................
3. Amplification des banques de bactéries.................................................................
4. des de phagemides...........................................................
II. Criblage des banques de scFv.......................................
1. Sélection sur immunotubes.....................................................................................