Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur

Denis Filisetti

Description

Niveau: Supérieur

• mémoire

Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Sciences du vivant par Denis Filisetti Vaccination génique contre la toxoplasmose chez la souris : mise au point et validation de huit candidats vaccins Soutenue publiquement le 26 janvier 2006 Membres du jury Directeur de Thèse : Monsieur Ermanno Candolfi, PU-PH, Strasbourg Rapporteur Interne : Madame Anne-Marie Aubertin, DR INSERM, Strasbourg Rapporteur externe, Présidente du Jury : Madame Isabelle Villena, PU-PH, Reims Rapporteur externe : Monsieur Hervé Pelloux, PU-PH, Grenoble

• préparation de l'adn de la souche rh de toxoplasma gondii


• vaccin


• vaccins constitués de souches vivantes


• stratégie de mutation des gènes vaccinaux pour le ciblage des antigènes protéiques


• analyse bioinformatique des séquences des gènes codant les protéines vaccinantes


• interrogation de la banque de données nucléotidiques


• vaccination avec la protéine gra2

Sujets

• Mémoire
• Louis Pasteur University
• Aubertin
• Institut national de la santé et de la recherche médicale
• Pelloux
• Villena
• Vaccination

Informations

• Publié par: profil-nechor-2012
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 62
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

Thèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur
Strasbourg I
Discipline : Sciences du vivant
par Denis Filisetti
Vaccination génique contre
la toxoplasmose chez la souris :la toxoplasmose chez la souris :
mise au point et validation
de huit candidats vaccinsde huit candidats vaccins
Soutenue publiquement le 26 janvier 2006
Membres du jury
Directeur de Thèse : Monsieur Ermanno Candolfi, PU-PH, Strasbourg
Rapporteur Interne : Madame Anne-Marie Aubertin, DR INSERM, Strasbourg
Rapporteur externe, Présidente du Jury : Madame Isabelle Villena, PU-PH, Reims
Rapporteur externe : Monsieur Hervé Pelloux, PU-PH, GrenobleDédicace
A la mémoire d’Isabelle Ruolt.
iiRemerciements
A notre directeur de thèse, Monsieur le Professeur Ermanno Candolfi.
Votre dynamisme et votre enthousiasme nous engagèrent à travailler à ce projet sous votre direction.
Les années passant, ces qualités ne vous ont pas quitté, malgré les difficultés que nous avons
rencontrées. Accompagnant nos doutes et nos questionnements, vous avez fait cheminer notre
réflexion personnelle vers des lieux riches en découvertes. Il est indéniable que cela nous aura
changé, ce qui ne constitue pas le moindre des effets de ce travail.
A notre rapporteur interne, Madame le Docteur Anne-Marie Aubertin.
Vous nous avez ouvert les portes de votre unité afin que nous puissions utiliser le matériel nécessaire
à la réalisation de ce travail. En acceptant d'être rapporteur de notre travail de thèse de doctorat en
sciences, vous nous honorez en vous y intéressant et en le jugeant.
A notre rapporteur externe et présidente du jury, Madame le Professeur Isabelle Villena.
Vous nous honorez doublement puisque non seulement vous avez accepté de considérer notre travail
et de le juger mais vous avez aussi accepté de présider ce jury.
Soyez en chaleureusement remerciée.
A notre rapporteur externe, Monsieur le Professeur Hervé Pelloux.
Dès nos premiers pas dans le domaine de la parasitologie, vous avez montré bienveillance à notre
égard et porté intérêt à notre travail. Soyez donc remercié vivement puisque vous avez aussi accepté
de juger notre travail, ce qui nous honore.
A celles et ceux sans qui ce travail n’aurait pas été possible.
iiiTable des Matières
INTRODUCTION 1
1. La toxoplasmose humaine ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1
2. Réponse immunitaire permettant de survivre à une toxoplasmose----------------------------------------------- 2
3. Présentation des antigènes au système immunitaire----------------------------------------------------------------- 3
3.1. La voie de présentation utilisant le CMH de classe I ---------------------------------------------------------- 3
3.2. La voie de présentation utilisant le CMH de classe II --------------------------------------------------------- 5
4. Vaccins à ADN -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9
4.1. Historique------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 9
4.2. Caractéristiques d’un vaccin à ADN --------------------------------------------------------------------------- 10
4.3. Avantages des vaccins à ADN----------------------------------------------------------------------------------- 11
4.4. Désavantages des vaccins à ADN ------------------------------------------------------------------------------ 12
4.5. Choix du vaccin à ADN ------------------------------------------------------------------------------------------ 13
4.6. Stimulation du système immunitaire par les vaccins à ADN ------------------------------------------------ 13
5. Les vaccins développés contre la toxoplasmose--------------------------------------------------------------------- 16
5.1. Vaccins constitués de souches vivantes et atténuées de Toxoplasma gondii ------------------------------ 18
5.2. Vaccins sous-unitaires protéiques ------------------------------------------------------------------------------ 19
5.2.1. Vaccination avec la protéine SAG1 ---------------------------------------------------------------------- 19
5.2.2.vec la protéine GRA2 23
5.2.3. Vaccination avec la protéine SAG3 23
5.3. Vaccins à ADN ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 24
5.3.1. Prévention de la toxoplasmose aiguë--------------------------------------------------------------------- 24
5.3.1.1. Prévention de la toxoplasmose aiguë létale-------------------------------------------------------- 27
5.3.1.2. Prévention de la toxoplasmose aiguë sub-létale--------------------------------------------------- 29
5.3.2. Prévention de la toxoplasmose chronique --------------------------------------------------------------- 30
iv5.3.3. Prévention de la toxoplasmose congénitale-------------------------------------------------------------- 34
5.4. Comparaison des vaccins à ADN et protéiques dans la prévention de la toxoplasmose ---------------- 34
6. Projet de travail : construction de vaccins à ADN contre la toxoplasmose en fonction de la présentation
au CMH et mesure de l’efficacité vaccinale ---------------------------------------------------------------------------- 35
6.1. SAG1---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36
6.2. GRA2 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
6.3. SAG3 40
6.4. SAG1, GRA2 et SAG3 sont trois protéines possédant un peptide signal C-terminal--------------------- 42
6.5. SAG1 et SAG3 sont deux protéines ayant un ancrage GPI-------------------------------------------------- 44
6.6. Stratégie de mutation des gènes vaccinaux pour le ciblage des antigènes protéiques vaccinaux dirigé
vers une voie de présentation aux lymphocytes T par le CMH------------------------------------------------------- 45
MATERIEL ET METHODES 48
1. Analyse bioinformatique des séquences des gènes codant les protéines vaccinantes SAG1, GRA2 et
SAG3--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48
1.1. Interrogation de la banque de données nucléotidiques GenBank à la recherche des séquences
contenant les gènes SAG1, GRA2 et SAG3 ----------------------------------------------------------------------------- 48
1.2. Téléchargement des séquences nucléotidiques contenant les gènes SAG1, GRA2 et SAG3------------- 48
1.3. Comparaison des séquences nucléotidiques contenant les gènes SAG1, GRA2 et SAG3---------------- 49
1.4. Détermination du signal d’ancrage GPI dans les séquences nucléotidiques de SAG1 et SAG3-------- 49
1.5. Analyse du biais d’usage des codons chez Toxoplasma gondii, Mus musculus et Homo sapiens ------ 50
2. Synthèse des séquences d’ADN des gènes SAG1, GRA2 et SAG3 sauvages et mutées---------------------- 51
2.1. Définition des amorces------------------------------------------------------------------------------------------- 51
2.2. Préparation de l’ADN de la souche RH de Toxoplasma gondii -------------------------------------------- 52
2.3. Synthèse des gènes par PCR haute fidélité -------------------------------------------------------------------- 52
2.4. Electrophorèse analytique --------------------------------------------------------------------------------------- 53
2.5. Purification des gènes synthétisés ------------------------------------------------------------------------------ 54
v3. Clonage des gènes synthétisés dans pGEM-T----------------------------------------------------------------------- 54
3.1. Ajout de désoxyadénosine à l’extrémité 3’ des gènes synthétisés------------------------------------------- 55
3.2. Quantification de l’ADN des gènes synthétisés --------------------------------------------------------------- 55
3.3. Insertion des gènes synthétisés dans le vecteur de clonage pGEM-T -------------------------------------- 55
3.4. Transformation de bactéries compétentes par les constructions plasmidiques --------------------------- 56
3.5. Sélection des bactéries transformées --------------------------------------------------------------------------- 57
3.6. Vérification de l’insertion des gènes synthétisés dans pGEM-T -------------------------------------------- 58
3.7. Culture des bactéries transformées avec le vecteur pGEM-T ayant intégré le gène synthétisé--------- 60
3.8. Purification du vecteur pGEM-T-------------------------------------------------------------------------------- 60
3.9. Vérification de la séquence des gè