Unité de recherche Dynamique

Louis Pasteur

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8

• redaction

1 Unité de recherche : Dynamique, évolution et expression de génomes de microorganismes (FRE 2326) Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé En vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences de l' Université Louis Pasteur Discipline : biologie cellulaire et moléculaire Etude de la diversité génétique de l'espèce Campylobacter jejuni par l'utilisation de puces à ADN Présentée et soutenue publiquement par : Frédéric Poly Le 22 avril 2005 Jury : Mario Keller Président du Jury Agnès Labigne Rapporteur externe Pierre Cornelis Rapporteur externe Jean-Marie Meyer Directeur de thèse Alain Stintzi Co-Directeur de thèse

• jejuni


• facteurs de pathogénicité chez campylobacter jejuni


• ecole doctorale des sciences de la vie et de la santé


• préparation d'adn plasmidique pour la construction de banque


• adn


• séquences des génomes

Sujets

• Redaction
• Cornelis
• Brignon
• Whitworth
• United States
• Vincent
• Keller
• Turcot
• Pasteur

Informations

• Publié par: profil-feym-2012
• Publié le: 01 avril 2005
• Nombre de lectures: 37
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 1 Mo

Extrait

1







Unité de recherche : Dynamique,
évolution et expression de génomes de
microorganismes (FRE 2326)

Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé
En vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences de l’ Université
Louis Pasteur
Discipline : biologie cellulaire et moléculaire


Etude de la diversité génétique de l’espèce
Campylobacter jejuni par l’utilisation de
puces à ADN

Présentée et soutenue publiquement par :

Frédéric Poly

Le 22 avril 2005



Jury :
Mario Keller Président du Jury
Agnès Labigne Rapporteur externe
Pierre Cornelis
Jean-Marie Meyer Directeur de thèse
Alain Stintzi Co-Directeur de thèse
2

Remerciements

Je voudrais tout d’abord remercier Alain Stintzi pour m’avoir accueilli dans son
laboratoire et permis de poursuivre mes travaux de recherche. Je lui exprime toute ma
reconnaissance pour son initiation aux techniques de biologie moléculaire. Sa patience et
ses connaissances seront toujours pour moi une source d’inspiration.

Je remercie Jean-Marie Meyer pour m’avoir convaincu de poursuivre mes recherches aux
Etats-Unis. Je tiens à lui exprimer mon entière reconnaissance pour son aide et son
support qu’il m’a apportés tout au long de ma thèse et de la rédaction de ce manuscrit.

Je remercie Madame Agnès Labigne, Messieurs Pierre Cornelis et Mario Keller, d’avoir
bien voulu accepter d’évaluer ces travaux.

Je tiens également à remercier mes collègues de travail, Lisa Whitworth, Hemant
Naikaire et Kiran Palayda pour leur soutien et leur aide au laboratoire.

Je voudrais également remercier Isabelle Turcot, Corinne Snownoski, Nathalie Brignon,
Nicolas Tuaillon et Thierry Vincent pour leur soutien constant et leur amitié apportée lors
de mon séjour aux Etats-Unis.

Je voudrais exprimer ma profonde gratitude à mes parents qui m’ont continuellement
apporté un support indispensable à la réalisation de mes buts, à Emmanuel et Alexandra
pour leur soutien moral et finalement à Ashli pour avoir partagé ma vie ces 2 dernières
années.


3
Sommaire
Liste ds figures 8
Liste des tableaux 10
Préambule 11
Abréviatons 13

Chapitre I : Introduction 15

1 Description générale de l’espèce Campylobacter jejuni 16

2 Facteurs de pathogénicité chez Campylobacter jejuni 9
2-1 Définition 19
2-2 Glycosylation de protéines 20
2-3 Le système de O-glycosylation 21
2-4 système N-glycosylation 23
2.5 Capsule 24
2.6 Lipooligosaccharide (LOS) 26
2.7 Toxines 30

3 Vue d’ensemble des techniques de comparaison de génomes : cas 33
des bactéries entéropathogènes.
3-1 Introduction 33
3-2 Qu’ont besoin les bactéries pour devenir pathogènes? 34
3-2-1 Acquisition de pathogénicité via des plasmides 35
3-2-2 Acquisition de pathogénicité via un PAI 37
3-2-2-1 Définition d’un PAI 37
3-2-2-2 Système de sécrétion 38
3-2-2-3 Invasine, moduline et effecteurs 39
3-2-2-4 Toxines 40
3-2-2-5 Système d’acquisition de fer 40
3-3 Méthodes d’étude comparative des génomes bactériens 40 4
3-3-1 Introduction 40
3-3-2 Apport du séquençage d’autres bactéries entériques 42
pathogènes .
3-3-2-1 génome de Yersinia pestis 42
3-3-2-1-1 Y. pestis Biovar Orientalis 42
souche CO92
3-3-2-1-2 Y. pestis biovar Mediaevalis 44
souche KIM
3-3-2-2 Séquences génomiques d’Helicobacter pylori 45
3-3-2-3 Le génome de Salmonella enterica 47
sérovar typhi
3-3-2-4 Génomes de Shigella flexneri. 49
3-3-2-5 Séquençage du génome de la souche 50
E. coli O157:H7
3-3-2-6 Séquences des génomes de 52
Vibrio paraheamolyticus et Vibrio cholerae
3-4-2-7 Comparaisons des génomes de 53
bactéries du genre Campylobacter
3-3-3 Hybridation soustractive (SSH) 57
3-3-3-1 Introduction 57
3-3-3-2 Technique
3-3-3-3 Applications 59
3-3-4 Comparaison génomique par utilisation de puces à ADN 62
3-3-5 Puces à ADN de type « shotgun » 66

Chapitre II : Matériels et Méthodes 68

1 Souches bactériennes, lignées cellulaires et conditions de culture 69
5
2 Mesures de concentration d’ADN 69

3 Test d’invasion bactérienne 70

4 Tests préliminaires à la fabrication de la puce à ADN par «shotgun ». 71
4-1 Elimination de l’ADN chromosomique 71
4-2 Restriction du plasmide 71
4-3 Dénaturation de l’ADN par chauffage
4-4 Préparation, marquage et hybridation des sondes 72

5 Construction de puces à ADN des souches C. jejuni 81-176 et TGH 9011 72
5-1 Extraction de l’ADN chromosomique de C. jejuni 72
5-2 Nébulisation 73
5-3 Clonage dans un vecteur plasmidique 74
5-3-1 Réalisation d’extrémités franches 74
5-3-1-1 Principe 74
5-3-1-2 Réaction 75
5-3-2 Déphosphorylation du vecteur 75
5-3-3 Ligation 76
5-4 Transformation par électroporation 76
5-5 Conservation des clones 77
5-6 Préparation d’ADN plasmidique pour la construction de banque 77
génomique
5-7 Dépôts des ADN plasmidiques 79

6 Hybridation des puces à ADN 80
6-1 Prétraitement des puces avant utilisation 80
6-2 Marquage de l’ADN 81
6-2-1 Principe 81
6-2-2 Amorçage aléatoire ou « Random priming » 82
6-2-3 Marquage fluorescent 82 6

7 Révélation de l’hybridation et sélection de spots uniques 83
7-1 Révélation de l’hybridation 83
7-2 Sélection des spots spécifiques à la souche testée 83

8 Sélection des ORFs de la souche C. jejuni NCTC 11168 absents de 84
la souche C. jejuni TGH 9011
8-1 Sélection 84
8-2 Vérifications 85

9 Détermination des clones correspondants au plasmide pTet de C.jejuni 81-176 85

10 Séquençage des clones et annotation 86

11 Etudes des gènes régulés par la protéine Fur par utilisation de la puce 87
à ADN de TGH 9011
11-1 Clonage du gène fur dans un vecteur d’expression. 87
11-1-1 Conception d’amorces 88
11-1-2 PCR 88
11-1-3 Clonage 89
11-1-4 Vérifications des clones 90
11-2 Obtention de la protéine 90
11-2-1 Culture 90
11-2-2 Lyse 91
11-2-3 Purification 91
11-2-4 Vérifi 92
11-3 Synthèse d’anticorps anti-Fur 92
11-4 Immunoprécipitation de la protéine Fur liée à l’ADN 93
chromosomique
11-4-1 Préparation des cellules, fixation, lyse bactérienne 93
et ultrasonation 7
11-4-2 Immunoprécipitation 94

Chapitre III : Identification des gènes spécifiques à 95
la souche Campylobacter jejuni TGH 9011

1 Introduction 96
2 Publication 97
3 Résultats additionnels 113

Chapitre IV : Identification des gènes spécifiques à la 116
souche Campylobacter jejuni 81-176

1 Introduction 117
2 Publication 117
3 Résultats additionnels 158

Chapitre V : Utilisation de la puce à ADN de C. jejuni 166
TGH 9011 pour la caractérisation des gènes régulés par Fur

1 Clonage du gène fur dans un vecteur d’expression 169
2 Analyses préliminaires d’immunoprécipitation 173
3 Immunoprécipitation de la protéine Fur liée à l’ADN chromosomique 174
3-1 Application 174
3-2 Calculs théoriques de la quantité d’anticorps et 174
de billes MagnaBind à utiliser pour l’immunoprécipitation.

Chapitre VI: Conclusion et Perspectives 176
Références 180


8
Liste des figures

Chapitre I
Figure 1 : Photo de C. jejuni par microscopie électronique (x 10000) 16
Figure 2 : Nombre de cas de maladies à entéropathogènes, relevés 17
en 2002 aux Etats-Unis (source FoodNet)
Figure 3 : Dissection de poulet mettant en évidence les ceca 18
Figure 4 : Représentation de différents locus de modification des flag