LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES ACIDES AMINES SOUFRES CHEZ LES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX : ANALYSE MOLECULAIRE, BIOCHIMIQUE ET PHYSIOLOGIQUE DE LA CYSTATHIONINE g-LYASE DE MAGNAPORTHE GRISEA

Audrey Beaurepaire

Description

Niveau: Supérieur, Master, Bac+5
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Audrey BEAUREPAIRE Pour l'obtention du Diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES ACIDES AMINES SOUFRES CHEZ LES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX : ANALYSE MOLECULAIRE, BIOCHIMIQUE ET PHYSIOLOGIQUE DE LA CYSTATHIONINE g-LYASE DE MAGNAPORTHE GRISEA Soutenu le 25 juin 2004 devant le jury suivant : Mr Jean-Marie EXBRAYAT - Président Mme Flore RENAUD-PAITRA - Rapporteur Mr Jean-Marc LANCELIN - Examinateur Mr Roland BEFFA - Examinateur Mr Michel DROUX - Examinateur Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) Directeur : Bernard MIGNOTTE e-mail : Laboratoire de Physiologie Cellulaire Végétale UMR CNRS-Bayer CropScience Directeur : Dominique JOB e-mail : EPHE Banque de Monographies SVT 1

• cgl1


• magnaporthe grisea


• voie de biosynthese des acides amines


• analyse moleculaire


• champignons filamenteux


• reconstitution de l'enzyme


• voie


• préparation de l'extrait protéique

Sujets

• Beaurepaire
• Magnaporthe grisea

Informations

• Publié par: profil-afte-2012
• Publié le: 01 juin 2004
• Nombre de lectures: 64
• Langue: Français

Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE     ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES   Sciences de la Vie et de la Terre       MEMOIRE     présenté   par     Audrey BEAUREPAIRE       Pour l'obtention du Diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes       LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES ACIDES AMINES SOUFRES CHEZ LES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX : ANALYSE MOLECULAIRE, BIOCHIMIQUE ET PHYSIOLOGIQUE DE LA CYSTATHIONINE g-LYASE DEMAGNAPORTHE GRISEA         Soutenu le 25 juin 2004 devant le jury suivant :      Mr Jean-Marie EXBRAYAT - Président  Mme Flore RENAUD-PAITRA - Rapporteur  Mr Jean-Marc LANCELIN - Examinateur  Mr Roland BEFFA - Examinateur  Mr Michel DROUX - Examinateur         Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) Directeur : Bernard MIGNOTTE e-mail : [e-mail]   Laboratoire de Physiologie Cellulaire Végétale UMR CNRS-Bayer CropScience Directeur : Dominique JOB e-mail : [e-mail]

   

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES ACIDES AMINES SOUFRES CHEZ LES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX : ANALYSE MOLECULAIRE, BIOCHIMIQUE ET PHYSIOLOGIQUE DE LA CYSTATHIONINE g-LYASE DEMAGNAPORTHE GRISEA Audrey BEAUREPAIRE   25 juin 2004   La voie d’assimilation du sulfate et de biosynthèse des acides aminés soufrés présente de grandes différences selon le règne étudié. Ces différences se retrouvent principalement au niveau de la voie de transsulfuration, qui fait le lien entre la synthèse de cystéine et de méthionine. Selon les organismes, cette voie se compose d’une voie de transsulfuration directe, permettant la synthèse d’homocystéine à partir de cystéine (par l’intermédiaire de la cystathionine), et/ou d’une voie de transsulfuration inverse, qui permet l’obtention de cystéine à partir d’homocystéine. La voie de transsulfuration inverse est la seule présente chez les mammifères, tandis qu’elle est absente chez les plantes et les bactéries. Chez les champignons, et notamment chez le phytopathogène modèle Magnaporthe grisea, la voie de biosynthèse des acides aminés soufrés, et plus particulièrement la voie de transsulfuration, nous intéresse dans le cadre d’une interaction plante - champignon. Plusieurs pistes laissent en effet penser que cette voie joue un rôle non négligeable dans le processus infectieux. Son étude pourrait conduire à l’identification de nouvelles stratégies appliquées à la protection des cultures. Mais contrairement aux plantes et aux bactéries qui nous servent aujourd’hui de modèles comparatifs, nos connaissances de cette voie chez les champignons sont encore limitées. La cystathionine g-lyase (CGL), deuxième enzyme de la voie de transsulfuration inverse, appartient à la famille des enzymes à pyridoxal-phosphate et catalyse le clivage en position g de la cystathionine pour produire de la cystéine, de l'a-cétobutyrate et de l'ammoniac. Afin de connaître les propriétés biochimiques de cette enzyme chez les champignons, l'ADNc codant la CGL de Magnaporthe grisea souche d’ a été utilisé pour construire uneEscherichia   coli productrice de cette enzyme en grande quantité. La CGL recombinante a été isolée grâce à une méthode rapide et efficace de purification en deux étapes. La protéine native recombinante, purifiée à l’homogénéité apparente, est un tétramère composé de quatre sous-unités identiques de 45 kDa. Elle utilisein vitro, outre la cystathionine, la lanthionine, le djenkolate et la cystine, et possède donc également une activité b- lyase. La CGL purifiée deMagnaporthe grisea réaction. inhibée par la cystéine, le produit de la est Elle est également inhibée, de manière irréversible, par la PAG et l’AVG, analogues respectifs du produit (cystéine) et du substrat (cystathionine) de la réaction. Les propriétés physico-chimiques et cinétiques de la CGL recombinante deMagnaporthe grisea des autres sont très différentes de celles CGL et des CBL, notamment pour la spécificité de substrat et son comportement vis-à-vis des inhibiteurs testés. Cette enzyme a également été étudiée au niveau physiologique. Une étude préliminaire a permis de proposer que l’ARNm pourrait être préférentiellement exprimé dans la spore. Afin d’observer la localisation subcellulaire de la protéine CGL1, la construction d’une protéine fusion avec un marqueur fluorescent (HcRed) a été réalisée. En parallèle, dans le but de déterminer le rôle physiologique de l’enzymein vivo, une seconde construction a été initiée, permettant la délétion du gèneCGL1 par recombinaison homologue. Cette dernière approche conduira à la caractérisation d’un mutant déficient en CGL. La souche P1.2 deMagnaporthe griseasera bientôt transformée avec ces constructions pour répondre aux interrogations posées.   MOTS CLES : champignon phytopathogène, cystéine, cystathionine g-lyase,Magnaporthe grisea, métabolisme du soufre, méthionine, voie de transsulfuration   TABLE DES MATIERES

    INTRODUCTION.......................................................................................... p 1   EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE........................................................................... p 3 1- PRESENTATION DE LA VOIE DU SOUFRE CHEZ LES ETRES VIVANTS................................... p 3  1 oduction...................................................................................... p 3 -1- Intr  1-2- La voie d’assimilation du sulfate.................................................................. p 4 1-2-1- Chez les bactéries.............................................................................................................. p 4 1-2-2- Chez les plantes................................................................................................................ p 4 1-2-3- Chez la levure et les champignons filamenteux........................................................................ p 5  1-3- L’incorporation du sulfate dans un squelette carboné.............................................. p 5  1-3-1- Chez les bactéries ............................................................................................................ p 5  1-3-2- Chez les plantes................................................................................................................ p 6  1-3-3- Chez la levure.................................................................................................................. p 6                       1-3-4- Chez les champignons filamenteux........................................................................................ p 6 2- LA BIOSYNTHÈSE DES ACIDES AMINÉS SOUFRÉS PAR LA VOIE DE TRANSSULFURATION............ p 7  2-1- Présentation...................................................................................... p 7  2-2- Chez les bactéries................................................................................. p 7  2-3- Chez les plantes.................................................................................. p 7  2-4- Chez la levure.................................................................................... p 8  2-5- Chez les champignons filamenteux................................................................ p 9  2-6- Chez les mammifères.............................................................................. p 9 3- PROBLÉMATIQUE.......................................................................................... p 10  3-1 Métabolisme du soufre et pathogénie des champignons filamenteux................................ p 10   -  3 Le champignon étudié :Magnaporthe grisea..................................................... p 11 -2-  3-2-1- Présentation..................................................................................................................... p 11  3-2-2- Cycle infectieux............................................................................................................... p 12  3-2-3- Un champignon modèle...................................................................................................... p 13  3-3- Présentation de la thématique : étude d’une enzyme de la voie de transsulfuration inverse, la  cystathionine g-lyase.................................................................................. p 13 4- LA CYSTATHIONINE G-LYASE............................................................................. p 14  4- La CGL de bactéries de type autre qu’Escherichia coli............................................. p 14 1-  4-2- La CGL de levure................................................................................. p 15  4-3- La CGL de champignons......................................................................... p 15  4-4- La CGL de mammifères............................................................................ p 16  4-5- Inactivation de la CGL par des inhibiteurs de type "substrat-suicide"............................... p 17   5- OBJECTIFS DU STAGE ET MOYENS MIS EN ŒUVRE ............................................. p 18   MATERIELS ET METHODES............................................................................ p 19 1- TECHNIQUES D’ÉTUDE DES ACIDES NUCLEIQUES....................................................... p 19  1-1- Souches bactériennes, souches fongiques et plasmides utilisés..................................... p 19  1-1-1- Souches bactériennes.......................................................................................................... p 19  1-1-2- Souches fongiques.............................................................................................................. p 19  1-1-3- Plasmides........................................................................................................................ p 19  1-2- Extraction des acides nucléiques.................................................................. p 21  1-2-1- Extraction d’ADN plasmidique bactérien................................................................................ p 21  1-2-2- Extraction d’ARN totaux fongiques........................................................................................ p 21  1-3- Amplification d'un fragment d’acide nucléique par PCR............................................ p 21  1-3-1- La PCR classique.............................................................................................................. p 21  1-3-2- La RACE PCR.................................................................................................................. p 22  1-3-3- Criblage de colonies par PCR............................................................................................... p 22  1-4- Electrophorèse sur gel d'agarose................................................................... p 23  1-5- Purification de fragments d’ADN.................................................................. p 23  1-5-1- Par extraction de gel.......................................................................................................... p 23  1-5-2- Par précipitation à l’éthanol................................................................................................ p 23  1-6- Techniques de clonage........................................................................... p 24  1-6-1- Digestion enzymatique....................................................................................................... p 24  1-6-2- "Remplissage" des extrémités cohésives.................................................................................. p 24  1-6-3- Déphosphorylation du vecteur............................................................................................... p 24  1-6-4- Ligation de fragments d’ADN............................................................................................... p 24