PDF Résultats et discussion Parties II VI Conclusion et Bibliographie

Vincent Renouf

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Lire la première partie de la thèse

• vagues microbiennes durant les vinifications


• vendanges


• moût


• foulage des baies


• millilitre de moût de raisin après le foulage


• sulfitage


• baie


• espèces fermentaires

Sujets

• Vendange
• Dioxyde de soufre en ?nologie

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
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Extrait

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications

P ARTIE II.L ES VAGUES MICROBIENNES DURANT LES VINIFICATIONS .

ILa microflore du moût. Le nombre de micro-organismes comptés sur une baie de raisin ne correspond pas au nombre de micro-organismes comptés par millilitre de moût de raisin après le foulage. Dès que la microflore de la pellicule entre en contact avec le jus elle est numériquement bien plus élevée. Le tableau XXXI rapporte les données obtenues pendant les trois millésimes étudiées (2003, 2004 et 2005), pour différents cépages. Les vendanges ont été sulfitées à des doses différentes et des moûts avaient des pH allant de 3,39 au minimum à 3,92 au maximum. Les populations de levures exprimées en UFC/mL de moût (A) sont toujours supérieures à celles exprimées en UFC/baie (B). Les chiffres ne montrent pas de corrélation entre la dose de sulfitage et la population. Il en est de même si l’on considère uniquement le pH. Il faut tenir compte de la population sur la baie au moment des vendanges. Par exemple, en 2003, le 4 lot de Merlot qui présentait une population dans le moût de 3,2×10 UFC/mL peut sembler plus affecté par le sulfitage que le lot de Cabernet-Franc du même millésime qui avait une 6 population de 3,96×10 UFC/mL dans le moût. La différence de pH entre ces lots (3,53 contre 3,78) conforterait même cette hypothèse. Mais il n’en n’est rien puisque pour le lot de Merlot 2 sur la baie était de 2.10 UFC/baie, elle a donc augmenté d’un facteur 160 tandis que celle du lot de Cabernet-Franc n’a progressé que d’un facteur légèrement supérieure à 20. Finalement le pH plus acide du lot de Merlot n’a pas mieux enrayé la multiplication par le sulfitage. De même, on n’observe pas de corrélation entre le rapport A/B des populations ni avec le pH, ni avec le SO 2 . Le pH pourrait sembler plus déterminant que le SO 2 le rapport A/B le puisque plus élevé (250) correspond au moût qui présente le pH le plus élevé (3,92) malgré un sulfitage relativement important (7 g/hL). De même un des plus faibles rapport A/B (2,0) est obtenu issu du moût le plus acide (3,39) et le plus sulfité (8 g/hL). Mais il existe tout de même un cas où le rapport A/B est élevé (240) pour un pH « classique » (3,55) et un sulfitage moyen (6 g/hL).

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications Finalement, l’absence de corrélation entre les populations microbiennes sur le raisin, dans le moût, le pH et la dose de sulfitage de la vendange indique qu’il est difficile de prédire le comportement des micro-organismes dans le moût au tout début de la vinification en tenant compte seulement de niveau de population sur la baie, du pH et de la dose de SO 2 ajoutée. Il est probable que d’autres facteurs chimiques (concentrations en sucres, en composés phénoliques…) doivent être pris en compte. Mais le paramètre déterminant doit évidemment être la nature et la qualité (fermentaires ou non) des espèces détectées sur les baies susceptibles de se développer une fois dans le jus. Tableau XXXI. Effets du cépage, du millésime, et du SO 2  ajouté après le foulage des baies sur la population de levures totales sur les baies de raisins et dans le moût avant le levurage. Cépages Millésimes pH du SO 2 sur les baies  LT LT dans le moût [A] vendange lors de la après l’ajout de [B] (g/hL) vendange SO 2 et avant (UFC/baie) [B] l’éventuel levurage (UFC/mL) [A] 4 6 Merlot 2004 3,65 3 3,75×10 2,50×10 66,7 4 5 Merlot 2005 3,72 4 4,00×10 8,50×10 21,3 Cabernet- 3 5 sauvignon 2003 3,88 4 2,20×10 5,26×10 239,1 3 4 Merlot 2003 3,44 5 2,90×10 2,00×10 6,9 4 4 Merlot 2004 3,52 5 1,55×10 2,25×10 1,5 4 5 Merlot 2005 3,44 6 5,50×10 7,50×10 13,6 Petit- 2005 6 5 7 Verdot 3,84 2,50×10 1,70×10 68,0 Cabernet- 3 4 Sauvignon 2003 3,46 6 9,00×10 3,10×10 3,4 Cabernet- 4 6 Sauvignon 2004 3,55 6 1,00×10 2,40×10 240,0 Cabernet- 5 6 Sauvignon 2005 3,66 6 1,00×10 2,10×10 21 2 4 Merlot 2003 3,53 7 2,00×10 3,20×10 160,0 Cabernet- 5 6 Franc 2003 3,78 7 1,50×10 3,96×10 26,4 Petit- 3 5 Verdot 2003 3,92 7 3,25×10 7,96×10 244,9 Cabernet- 3 4 Sauvignon 2004 3,67 7 1,60×10 1,00×10 6,3 4 5 Merlot 2005 3,41 7 3,40×10 1,20×10 3,5 Cabernet- 6 7 Franc 2005 3,77 7 7,40×10 2,50×10 3,4 Cabernet- 3 4 Sauvignon 2004 3,63 8 6,00×10 2,00×10 3,3 4 4 Merlot 2005 3,39 8 1,10×10 2,20×10 2,0 5 6 Merlot 2005 3,55 8 1,00×10 7,50×10 75,0 Cabernet- 4 5 Sauvignon 2005 3,74 8 5,70×10 3,85×10 6,8

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications IILa fermentation alcoolique.

II.1Les cinétiques microbiennes durant une fermentation alcoolique « classique ». La figure 55 est un exemple de l’évolution des populations microbiennes couramment observée dans le cas des FA « classiques », sans levurage ni macération pré-fermentaire. Après le foulage des baies, toutes les populations microbiennes augmentent. Elles trouvent dans le moût, des conditions (disponibilité en substrats, activité de l’eau) certainement plus favorables qu’à la surface de la baie, notamment pour les espèces fermentaires qui deviennent très rapidement majoritaires.

1E+08

1E+07

1E+06

1E+05

L 1E+04 UFC/m

1E+03

1E+02

1E+01

1E+00 0

3

6 9 Jours après les vendanges

12

15

1,104

1,096

1,088

1,080

1,072

1,064

1,056

1,048

1,040

1,032

1,024

1,016

1,008

1,000

0,992 18

)

densité ( g/mL

Figure 55: Evolution des populations de levures totales (■), de levures non-Saccharomyces (▲), de bactéries à Gram positif (◊)et de bactéries à Gram négatif (●), de la densité (×) durant la FA d’un lot de Merlot du domaine IV vinifié en 2005.

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications Durant les premières heures, les populations de levures totales et de levures non- Saccharomycesne sont pas significativement différentes, ce qui traduit la faible proportion de Saccharomycesle moût fraîchement foulé. Il faut attendre le troisième jour après dans l’encuvage pour observer une réelle divergence entre ces populations. Dès lors, l’espèceS. 7 cerevisiae domine. Sa population atteint plus de 10 UFC/mL puis se stabilise. Durant la phase de croissance deS. cerevisiae, les autres populations diminuent. Les bactéries à Gram négatif disparaissent au comptage, tandis que les populations de bactéries lactiques et les 3 2 levures non-Saccharomycesse stabilisent à environ 10 - 10 UFC/mL. La prédominance de l’espèceSaccharomycess’explique par sa meilleure adaptation aux conditions du moût. Ses capacités de développement dans un milieu très riche en sucres et en composés phénoliques sont bien supérieures à celles des autres espèces (Nissen etal. 2003b). Très rapidement elle monopolise l’écosystème et prive les autres espèces des nutriments qu’elle utilise pour sa croissance. Ensuite son activité fermentaire diminue la concentration en sucres mais produit de l’éthanol inhibiteur des autres espèces sensibles. Outre cet effet, des inhibitions directes de type «cell to cell contact» (Nissen etal. 2003a) provoquées par la forte densité cellulaire enS. cerevisiae, mais aussi des interactions indirectes via des toxines produites parS. cerevisiaes’installent (Pérez etal. 2001). Le SO 2  est l’un des produits du métabolisme deS. cerevisiaed’influencer susceptible les autres micro-organismes. Sa production lors de la FA est fonction des souches deS. cerevisiae, de la composition du moût (Eschenbruch 1974) et d’autres contraintes physiologiques. Néanmoins des productions pouvant dépasser les 100 mg/L ont été observées (Dott etal. 1976). De telles quantités qui s’additionnent au SO 2 la vendange ont de probablement un effet inhibiteur sur les espèces les plus sensibles. Durant sa croissanceS. cerevisiaeproduit également des acides gras à chaînes moyennes comme l’acide décanoïque et docécanoïque (Edwards et Beelman 1990). Ils agissent normalement sur la levure elle- même mais aussi sur les bactéries lactiques (Lonvaud-Funel etal. 1988). Enfin la richesse du moût en composés phénoliques reconnus pour leur activité antibactérienne doit également contribuer à l’élimination des espèces les plus sensibles (Puupponen-Pimia etal. 2001). Malgré la toxicité croissante du milieu certaines levures non-Saccharomyces et bactéries 2 3 lactiques arrivent néanmoins à se maintenir. Leur population s’équilibre entre 10 et 10 UFC/mL afin la fin de la FA.

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications L’identification des colonies isolées sur boîte (Tableaux XXXII et XXXIII) montre l’évolution des proportions des différentes espèces microbiennes au cours d’une FA. Parmi les levures non-Saccharomyces, au début de la FA, les espècesHanseniaspora uvarum et Pichia anomalaavec les espèces du genre dominent Candida. Ces espèces doivent produire de nombreux métabolites qui participent à enrichir les qualités aromatiques du vin (Romano etal. 1997, Jolly et al. 2003, Fleet 2003). Mais elles ne supportent que faiblement l’éthanol (Pina etal. 2004). Leur proportion diminue tout au long de la FA. A son terme, il ne subsiste que les plus tolérantes à l’éthanol, et, à l’épuisement du milieu en sucres fermentescibles. C’est le cas de l’espèceB. bruxellensisjusqu’alors minoritaire. Tableau XXXII. Evolution de la concentration et de la proportion des espèces de levures non- Saccharomycesdurant la FA lors des suivis du millésime 2004. Espèces de levures non- Début de la FA Fin de la FA Saccharomyces (densité= 0,99)1,1) (densité=  % Concentrations % Concentrations (UFC/mL) (UFC/mL) 2 2 B. bruxellensis 80 0,8×1002 1,1×10 2 2 Candida cantarelli 8 0,08×1012 6,7×10 2 2 Candida stellata 12 6,7×10 4 0,04×10 2 Debaryomyces hansenii 14 7,7×10 - - 2 Hanseniaspora uvarum 22 12,2×10 - - 2 Metschnikowia pulcherrima - -12 6,7×10 2 2 Pichia anomala 8 0,08×1018 10,0×10 2 Pichia fermentans 08 4,4×10 - - 2 2 Total 100 5,55×10 100 1×10 Tableau XXXIII.Evolution de la concentration et de la proportion des espèces de bactéries lactiques durant la FA lors des suivis du millésime 2004. Espèces de bactéries lactiques Début de la FA Fin de la FA (densité= 1,1) (densité= 0,99)  % Concentrations % Concentrations (UFC/mL) (UFC/mL) 3 Bacillus sp. - - 08 0,25×10 3 Lactobacillus casei 04 0,12×10 - - 3 2 Lactobacillus plantarum 40 1,24×10 12 0,8×10 3 Lactobacillus sp. - - 04 0,12×10 3 Leuconostoc mesenteroïdes - -12 0,37×10 3 O. oeni 80 -20 0,62×10 3 2 Pediococcus damnosus 04 0,12×10 - 5,6×10 3 Pediococcus parvulus 8 -04 0,12×10 3 2 Pediococcus pentosaceus - 0,6×10 04 0,12×10 3 2 Total 100 3,1×10 100 7×10

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications B. bruxellensis est une espèce peu exigeante sur le plan nutritionnel (Uscanga etal. 2000) particulièrement tolérante aux fortes concentrations en éthanol (Medawar etal. 2003). Il est donc normal de la détecter en majorité parmi les levures non-Saccharomycesen fin de FA. Une sélection parallèle s’opère chez les bactéries lactiques, où les espèces du genre Lactobacillus, qui dominaient dans le moût cèdent progressivement la place à l’espèce O. oeniqui domine à la fin de la FA. Mais, si leur proportion au sein des NS et des BL augmente durant la FA, on remarque que la population desB. bruxellensis et desO. oenistable durant la fermentation. demeure Les chutes des populations de levures non-Saccharomyceset de bactéries anaérobies à Gram positif découlent de celles des espèces initialement majoritaires tandis que les espèces résistantes (respectivementB. bruxellensis etO. oeni) arrivent à se maintenir à leur concentration initiale. En ce qui concerne les bactéries acétiques, l’espèceG. oxydansla seule espèce est détectée dans le moût. Elle constitue la population des bactéries à Gram négatif dont la chute commence avec la FA. Cette espèce est peu tolérante à l’éthanol mais elle supporte très bien les concentrations élevées en sucres fermentescibles. Elle entre en compétition avec S. cerevisiaele moût mais elle doit être moins bien adaptée. Puis, la production dans

d’éthanol provoque son déclin. Les autres BA du raisin sont les espèces du genreAcetobacter. Elles résistent nettement mieux à l’éthanol puisqu’il s’agit de leur substrat carboné préférentiel qu’elles dégradent en acide acétique. Mais comme on peut le remarquer sur les gels de DGGErpoBles bactéries à Gram négatif sont systématiquement en bas du gel et les espèces du genreAcetobacter en sont même exclues. Leur détection ne peut se faire qu’à partir des colonies isolées sur les boîtes de milieu AGN par PCR-RFLP. Cette étape de culture nécessaire impose un seuil de détection plus élevé que l’analyse directe. Par conséquent, il est probable que lesAcetobacterissues du raisin persistent durant la FA mais en deçà des seuils de détection. Elles ne « réapparaissent » que lorsque les conditions sont plus favorables à leur développement mais aussi que la diversité microbienne a diminué, généralement à la suite du sulfitage post-fermentaire. Sur les gels de PCR-DGGE (Figure 56) les bandes d’O. oeniet deB. bruxellensissont les seules détectées à la fin de la FA. En ce qui concerne les bactéries on peut donc considérer

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications que dès le début du processus de vinification, les bactéries à Gram positif sont exclusivement des espèces de bactéries lactiques. Pour les levures non-Saccharomyces,B. bruxellensis devient nettement majoritaire en fin de FA. Par la suite la population de non-Saccharomyces sera donc assimilée àB. bruxellensis. Lorsque ces correspondances seront désavouées par des cas plus atypiques, ils seront signalés.

Hanseniaspora uvarum

Pichia anomala Candida stellata

Candida cantarelli

B. bruxellensis

Bacillussp. Bacillussp. Lactobacillus plantarum O. oeni

Lactobacillus casei

FREMENTATION ALCOOLIQUE

PCR DGGE NL1/LS2

PCR DGGErpoB

Figure 56: Gels de DGGENL1/LS2etrpoBréalisés à partir des ADN extraits des biomasses collectées sur les boîtes des NS et des BL. Concernant la méthode analytique par PCR-DGGErpoB, il est important de souligner que le faible nombre de séquencesrpoBdisponibles dans les banques de données pouvait être restrictif pour permettre une identification lors de l’analyse de la surface de la baie de raisin. Mais il n’en est rien dès lors que la vinification a réellement commencé. Puisqu’une banque de séquencesrpoB de l’ensemble des espèces de bactéries lactiques précédemment décrites dans les études oenologiques et disponibles au laboratoire avait été constituée.

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications Ces résultats démontrent qu’hormisS. cerevisiaeest naturellement la principale qui actrice de la FA, la levureB. bruxellensiset la bactérieO. oenisont les principales espèces à résister à cette première phase de la vinification. La description de ces phénomènes a été approfondie au laboratoire durant des expériences de co-cultures.

II.2Les interactions entre les micro-organismes durant la fermentation alcoolique - Observations de cultures mixtes au laboratoire.

II.2.1Les co-cultures bactéries lactiques /S. cerevisiae. Ces co-cultures sont réalisées dans un moût de raisins rouges stérilisé par filtration puis inoculé avecS. cerevisiae(souche 522Davis) et les bactéries lactiques :O. oeni,P.parvulus (IOEB 8801) etLactobacillus hilgardii(IOEB0001). Deux souches d’O. oenisont inoculées ( IEOB 8406, IOEB 9807). La première (IOEB 8406) dégrade l’arginine (arginine désaminase, métabolisme ADI+). La seconde produit de l’histamine (IOEB 9807) (histidine décarboxylase, métabolisme HDC+). L’évolution des BL durant la FA est estimée directement par PCR- DGGE, mais aussi par dénombrement sur milieu gélosé puis détermination de la proportion de chaque espèces par hybridation sur colonies avec des sondes spécifiques d’espèce. Par + + ailleurs, des sondes spécifiques des caractères Arg et HDC font la distinction entre les deux souches d’O. oeni. Aux deux pH étudiés, 3,5 et 3,7, l’espèce qui s’implante dans le moût estP. parvulus (Tableau XXXIV). Sur boîte,O. oenine devient détectable qu’à la fin de la FA à pH 3,4, mais + plus tôt à pH 3,7 et c’est la souche Arg qui prédomine. Au pH plus acide, l’implantation de + l’espèceO. oenien particulier, est plus tardive. Les niveauxen général, et de la souche Arg de populations sont également inférieurs à ce pH plus faible à la fin de la FA. Néanmoins aux deux pH, l’espèceO. oenirésiste le mieux à la FA. La PCR-DGGE, de son côté, démontre que les trois espèces de bactéries survivent bien et sont toutes présentes à tout moment de l’expérimentation (Figure 57). En particulier Lactobacillus hilgardii n’est jamais en population suffisante pour être identifiée par hybridation sur colonies. Mais la PCR-DGGErpoB montre sa présence accentuée en fin d’essai alors queP. parvulusDans le cadre de mélanges relativement simples, diminue.

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Résultatsetdiscussion -Lesvagues microbiennesdurantles vinifications l’élimination de l’étape de culture permet donc d’abaisser le seuil de détection relatif des espèces et donc d’améliorer la sensibilité de la mesure.

Parce qu’ils sont les principaux acteurs de la vinification, l’étude des interactions entre

la levureS. cerevisiae et la bactérieO. oeniont fait l’objet de plusieurs travaux. Des interactions directes entre les cellules (Lemaresquier 1987) mais également via des métabolites produits par les unes et agissant sur les autres (SO 2 , acides gras à chaîne moyenne) ont été décrits (Kling et Beelman 1986, Lonvaud-Funel etal. 1988). Ces interactions dépendent directement des souches deS. cerevisiae et d’O. oenimises en jeu (Larsen etal. 2003, Alexandre etal. 2004). Tableau XXXIV. Résultats des dénombrements et de l’identification des bactéries lactiques durant les 6 co-cultures de BL et deS. cerevisiaeUFC/mL.inoculées initialement à 10 pH=3,7 Jours 1 3 8 13 (fin de 17 20 la FA) 6 5 4 4 6 8 Population (UFC/mL) 1×10 7×10 2×10 3×10 2×10 3×10 Identification des colonies parL. hilgardii0 00 0 0 0 hybridation ADN/ADN (%)O. oeni10 70 0 0 10 90 HDC+ (parmi - - - 0 0 0 lesO. oeni) ADI+ (parmi les - - - 100 100 100 O. oeni) P. parvulus30 10100 100 100 90 PCR-DGGErpoBL. hilgardii+ + + + + + O. oeni+ ++ + + + P. parvulus+ ++ + + + pH=3,5 Jours 1 3 8 13 (fin de 17 la FA) 5 5 2 2 5 8 Population (UFC/mL) 5×10 3×10 3×10 2×10 7×10 1×10 Identification des colonies parL. hilgardii0 00 0 0 0 hybridation ADN/ADN (%)O. oeni20 500 0 0 0 HDC+ (parmi - - - - 30 20 lesO. oeni) ADI+ (parmi les - - - - 70 80 O. oeni) P. parvulus100 100 100 100 80 50 PCR-DGGErpoBL. hilgardii+ ++ + + + O. oeni+ ++ + + + P. parvulus+ + + + + +

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