STRASBOURG I FRANCE

Diane Bortolamiol

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I - FRANCE 2008 THESE Présentée à la FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE En vue de l'obtention du titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Domaine: Sciences du Vivant, Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Par Diane BORTOLAMIOL Les Polerovirus : Mode d'Action de leur Suppresseur et Approche Génétique du Tropisme Phloémien Soutenue publiquement le 4 novembre 2008 devant la Commission d'Examen: Pr. Jean-Luc IMLER Rapporteur Interne Pr. Fernando GARCIA-ARENAL Rapporteur Externe Pr. Christophe ROBAGLIA Rapporteur Externe Dr. Olivier VOINNET Examinateur Dr. Véronique ZIEGLER-GRAFF Directrice de Thèse Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (CNRS-IBMP UPR 2357)

• protéines p0


• infection de mutants dcl


• mouvement


• infection des mutants dcl par le virus bw95hp


• rna viraux


• inhibition du mouvement du rna silencing


• voie


• rna

Sujets

• Ziegler
• Mouvement

Informations

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Extrait

UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
STRASBOURG I - FRANCE
2008

THESE

Présentée à la
FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE
En vue de l'obtention du titre de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR

Domaine: Sciences du Vivant,
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Par

Diane BORTOLAMIOL


Les Polerovirus :
Mode d’Action de leur Suppresseur et
Approche Génétique du Tropisme Phloémien


Soutenue publiquement le 4 novembre 2008 devant la Commission d'Examen:

Pr. Jean-Luc IMLER Rapporteur Interne
Pr. Fernando GARCIA-ARENAL Rapporteur Externe
Pr. Christophe ROBAGLIA Rapporteur
Dr. Olivier VOINNET Examinateur Véronique ZIEGLER-GRAFF Directrice deThèse

Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (CNRS-IBMP UPR 2357)
Sommaire
Sommaire


Somaire 1

Acronymes, abréviations 5

Introduction 8

Première partie : les Luteoviridae 9
I-1) Particularités biologiques – classification 9
I-2) Gamme d’hôtes et symptômes 11
I-3) Processus épidémiologique et stratégies de contrôle des épidémies 12
I-4) Cycle viral 15
I-4-1) Mouvement dans la plante (hôte) 15
a) Mouvement de cellule à cellule 15
b) eà longue distance 17
c) Cas des Luteoviridae 20
I-4-2) Mouvement dans le puceron (vecteur) 23
a) Protéines du puceron impliquées dans la transmission 26
b) Méthodes d’inoculation artificielles 27
I-5) Expression des gènes des Luteoviridae 29
I-5-1) Organisation génomique 29
I-5-2) Stratégies d’expression 29
I-5-3) Fonctions connues des différentes protéines virales 32
a) La protéine P0 32
b) P1 32
c) La protéine P2 33
d) La protéine P3 ou protéine majeure de capside (CP) 33
e) La protéine P4 34
f) La protéine P5 ou protéine mineure de capside 36
g) Autres protéines virales putatives 38

Deuxième partie : le RNA silencing ou interférence à RNA 39
II-1) Protéines majeures du RNA silencing chez Arabidopsis thaliana 40
II-1-1) DICER 40
II-1-2) ARGONAUTE 41
1
Sommaire
II-1-3) RDR 43
II-1-4) SGS3 44
II-1-5) SDE3 45
II-1-6) POL IV 45
II-1-7) HEN1 46
II-1-8) DRB 46
II-1-9) HASTY 47
II-2) Les différentes voies du RNA silencing chez Arabidopsis thaliana 48
II-2-1) sRNA endogènes 48
a) Voie des miRNA (ou microRNA) 48
b) Voie des tasiRNA (trans-acting short interfering RNA) 49
c) Voie des nat-siRNAs (natural cis-antisense transcripts-associated siRNAs) 50
d) Voie des ha-siRNA (heterochromatin-associated short interfering RNA) 51
II-2-2) sRNA exogènes 53
a) Voie des siRNA (ou short interfering RNA) 53
b) RNA silencing antiviral 54
II-2-3) Transitivité et maintenance du silencing 57
II-2-4) Mouvement du signal du RNA silencing 58
a) Mouvement à courte distance 59
b) elocal étendu 60
c) Mouvement systémique 61
II-3) Suppresseurs viraux du RNA silencing 62
II-3-1) Inhibition de l’activité Dicer : exemple de la protéine P38 du TCV 63
II-3-2) Séquestration des sRNA : exemple de la protéine P19 des tombusvirus 64
II-3-3) Inhibition de l’activité d’Argonaute : exemple de la protéine 2b du CMV 65
II-3-4) Interférence avec l’activité RDR ? : exemple de la protéine V2 du TYLCV 67
II-3-5) Inhibition du mouvement du RNA silencing : exemple de la protéine P25 du PVX 67




Résultats et Discussion

Chapitre I : Etude du mode d’action de la protéine P0 des polerovirus 69
A) Introduction à la protéine P0 des polerovirus 69
1) Généralités sur la protéine P0 69
2) La protéine P0 est un « facteur de pathogénicité » 70
3) La protéine P0 est un suppresseur de RNA silencing 71
2
Sommaire
4) La protéine P0 est une protéine à F-box 72
4-1) les protéines ASK et la voie « ubiquitine-protéasome » 73
a) La voie de dégradation par le protéasome dépendante de l’ubiquitine 73
b) Le complexe SCF 75
4-2) le motif F-box de la protéine P0 est nécessaire à son activité de suppresseur 75
B) Résultats 76
1) La protéine P0 agit en aval de l’activité Dicer 76
2) La protéine P0 mime les effets d’une mutation ago1 chez Arabidopsis thaliana 78
3) La protéine P0 induit la dégradation d’AGO1 in planta 79
4) Les protéines P0 et AGO1 interagissent entre elles 80
Publication :
The Polerovirus F box protein P0 targets ARGONAUTE1 to suppress RNA silencing
Article addedum :
Viral suppression of RNA silencing by destabilization of ARGONAUTE 1
5) Le protéasome est-il responsable de la dégradation d’AGO1 induite par P0 ? 82
6) Effet de la protéine P0 en contexte viral 84
7) Conclusions, discussion et perspectives 86



Chapitre II : Approche génétique du tropisme phloémien des polerovirus 89
1) Problématique 89
2) Les produits de DICER sont-ils responsables du tropisme des polerovirus ? 90
2-1) Initiation du projet de recherche 90
2-2) Infection de mutants dcl 91
a) Analyse phénotypique 91
b) du titre en virus 93
c) Inoculation mécanique 94
2-3) Localisation tissulaire du BWYV dans les mutants dcl 94
a) Immunolocalisation sur des empreintes de pétioles 95
b) Immunolocalisation in stu 95
c) Localisation des particules virales par microscopie électronique 96
2-4) Analyse moléculaire des extraits de mutants dcl infectés 99
a) Protéines virales 99
b) RNA viraux 100
c) siRNA 101
2-5) Conclusions et hypothèses de travail 103
3
Sommaire
3) Le RNA viral est-il capable de sortir du phloème sous une forme différente
des virions ? 104
3-1) Construction d’un virus « rapporteur » 104
3-2) Analyse des virus « rapporteur » 106
3-3) Infection des mutants dcl par le virus BW95hp 109
4) Les polerovirus codent-ils pour un deuxième suppresseur de RNA silencing ? 111
4-1) Etude de l’effet de l’infection virale sur l’expression des gènes DCL 111
4-2) Recherche du deuxième suppresseur potentiel 113
4-3) Analyse de l’activité de suppresseur de RNA silencing de P4 sur N. benthamiana 116
5) Conclusions, discussion et perspectives 116

Conclusion génrale 120

Matériel tméthodes 30
I) Matériel 130
I-1) Milieux de culture 130
I-2) Bactéries 131
I-3) Plasmides 131
I-4) Virus 132
I-5) Plantes 132
I) Méthodes 133
II-1) Clonage 133
II-2) Expériences avec les plantes 136
II-3) Détection in situ de protéines virales 138
II-4) Extraction et analyse de 139
II-5) RNA 142
1I-6) RT-PCR et purification de DNA séparé sur gel de polyacrylamide 145

Références bibliographiques 147
4
Abréviations

Acronymes, abréviations



A : Ampère ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay
AGO : ARGONAUTE F : farad
APC : Anaphase Promoting Complex g : gramme
ARF : auxin responsive factor GAPDH3 : glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
ASK : Arabidopsis SKP1-like protein GFP : Green Fluorescent Protein
ATP : adénosine tri phosphate GST : glutathione S-transf