Thèse présentée pour obtenir le grade de

Stéphanie Blandin

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg Par Stéphanie BLANDIN Functional Analysis of Thioester-containing Proteins in Immune Responses of the Mosquito, Anopheles gambiae Soutenue le 23 février 2004 devant la commission d'examen : Prof. Fotis KAFATOS Directeur de Thèse Prof. Jules HOFFMANN Directeur de Thèse Prof. Bernard EHRESMANN Rapporteur Interne Prof. André CAPRON Rapporteur Externe Dr. Anne EPHRUSSI Rapporteur Externe Dr. Elena LEVASHINA Examinateur

• immune responses


• antimicrobial peptide plays


• parasite recognition


• vivo knockdown


• mosquito antimicrobial


• gene silencing

Sujets

• Blandin
• Capron
• Louis Pasteur University
• Hoffmann
• Ephrussi
• Immune system

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 février 2004
• Nombre de lectures: 150
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 10 Mo

Extrait

Thèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur de Strasbourg
Par
Stéphanie BLANDIN
Functional Analysis of Thioester-containing Proteins in
Immune Responses of
the Mosquito, Anopheles gambiae

Soutenue le 23 février 2004 devant la commission d’examen :
Prof. Fotis KAFATOS Directeur de Thèse
Prof. Jules HOFFMANN Thèse
Prof. Bernard EHRESMANN Rapporteur Interne
Prof. André CAPRON Rapporteur Externe
Dr. Anne EPHRUSSI
Dr. Elena LEVASHINA ExaminateurThèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur de Strasbourg
Par
Stéphanie BLANDIN
Functional Analysis of Thioester-containing Proteins in
Immune Responses of
the Mosquito, Anopheles gambiae

Soutenue le 23 février 2004 devant la commission d’examen :
Prof. Fotis KAFATOS Directeur de Thèse
Prof. Jules HOFFMANN Thèse
Prof. Bernard EHRESMANN Rapporteur Interne
Prof. André CAPRON Rapporteur Externe
Dr. Anne EPHRUSSI
Dr. Elena LEVASHINA ExaminateurEuropean Molecular Biology Laboratory
Meyerhofstrasse, 1
D-69117 Heidelberg
Germany
Tel: [phone]
Fax: [phone]
Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire
15 rue René Descartes
F-67087 Strasbourg Cedex
Cover picture: Green fluorescent parasites have invaded the mosquito salivary glands.
The fluorescence is visible through the cuticule.
iiAbstract
The mosquito Anopheles gambiae is one of the most important vectors of human malaria in
Africa. The causative agents of this disease are unicellular eukaryotic parasites of the genus
Plasmodium. They are transmitted to humans by infected female mosquitoes when they take
a blood meal. During its development in the mosquito, Plasmodium undergoes massive losses,
which suggests that mosquitoes are able to mount a potent immune response and to limit parasite
infection. However, the molecular mechanisms underlying parasite recognition and killing are
not well understood. To address this question, we have chosen to study Thioester-containing
proteins (TEPs) as this type of molecules is involved in pathogen recognition and activation of
immune responses in other organisms. Indeed in vertebrates, members of this family comprise the
universal protease inhibitors, α -macroglobulins, and the complement factors C3/C4/C5, which
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label pathogens and trigger their disposal through phagocytosis or cell lysis.
We identified a family of 15 TEP genes in the mosquito genome. To investigate the
function of these and other genes, we adapted the RNA interference strategy to knockdown gene
expression, either by transfection of cultured mosquito cells with double stranded RNA (dsRNA)
or by direct injection of adult mosquitoes with dsRNA. We further established a set of phenotypic
tests to analyze the effect of gene silencing on mosquito immune responses. In addition, we
extended the in vivo knockdown by dsRNA injection to adult D. melanogaster where it represents
a powerful method for rapid gene functional analysis and for rapid epistatic analysis.
Using these tools, we studied several aspects of the mosquito immune system, which
could not have been addressed before. We provided the first functional evidence that an insect
antimicrobial peptide plays an important role in the resistance to infections: Defensin1 is required
for the mosquito antimicrobial defense against Gram+, but not against Gram- bacteria. Functional
analysis of the mosquito Thioester-containing protein 1, TEP1, revealed that this molecule acts as
an opsonin and promotes phagocytosis of bacteria by hemocytes. In addition, the binding of TEP1
to Plasmodium parasites mediates their killing. Our data provide the first molecular identification
of a mosquito factor implicated in the establishment of vectorial capacity in A. gambiae. Further
elucidation of the mechanisms of TEP1 activation and of the effector mechanisms triggered by
TEP1 binding will be instrumental in our understanding of the mosquito immune responses, and
especially of that against parasites.
iiiRésumé
Le moustique Anopheles gambiae est l’un des principaux vecteurs du paludisme en Afrique.
L’agent responsable de la maladie, Plasmodium, est un parasite eucaryote unicellulaire. Il est
transmis à l’homme par un moustique femelle infecté lorsque celle-ci prend un repas de sang.
Au cours de son développement chez le moustique, Plasmodium subit de nombreuses pertes,
ce qui suggère que le moustique est capable de monter une réponse immunitaire et de limiter
le développement du parasite. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la
reconnaissance et l’élimination des parasites ne sont pas connus. Afin d’aborder ce problème, nous
avons choisi d’étudier les protéines à thioester (TEPs). En effet, des molécules de ce type sont
impliquées dans la reconnaissance des pathogènes et dans l’activation des effecteurs de la réponse
immunitaire chez d’autres organismes. Chez les vertébrés par exemple, on trouve dans cette
famille les α2-macroglobulines, qui sont des inhibiteurs universels de protéases, et les facteurs
C3/C4/C5 du complément, qui marquent les pathogènes et favorisent ainsi leur élimination par
phagocytose ou par lyse cellulaire.
Nous avons identifié 15 gènes TEP dans le génome du moustique. Afin d’analyser leur
fonction ainsi que celle d’autres gènes, nous avons adapté la technique d’interférence à ARN
pour l’anophèle : l’expression d’un gène peut être inhibée par transfection d’ARN double brin
(ARNdb) dans des cultures de cellules in vitro, ou par injection d’ARNdb dans des moustiques
adultes. Nous avons ensuite mis en place un ensemble de tests phénotypiques qui nous ont permis
d’étudier l’effet de ces knock-downs sur la réponse immunitaire du moustique face à divers
pathogènes. En outre, nous avons élargi l’application de cette méthode à la drosophile adulte où
le knock-down par injection d’ARNdb représente une méthode rapide pour l’étude fonctionnelle
et épistatique des gènes.
L’utilisation de ces outils nous a permis d’analyser plusieurs aspects du système
immunitaire du moustique, qui n’avaient pas pu être étudiés auparavant. D’une part, nous avons
donné la première caractérisation fonctionnelle d’un peptide antimicrobien d’insecte : Defensin1
est nécessaire pour la résistance du moustique aux bactéries à Gram+, mais pas aux bactéries à
Gram-. D’autre part, nous avons démontré que la protéine à thioester 1, TEP1 est une opsonine :
le marquage des bactéries par TEP1 active leur phagocytose par les hémocytes, De plus, TEP1 est
aussi capable de se fixer à la surface de Plasmodium et de déclencher son élimination. TEP1 est
le premier facteur impliqué dans l’établissement de la capacité vectorielle à être identifié chez A.
gambiae. L’analyse plus précise des mécanismes moléculaires qui activent TEP1 et de ceux qui
sont déclenchés par la fixation de TEP1 nous apparaît essentielle à une meilleure compréhension
du système immunitaire de l’anophèle, et en particulier de sa réponse antiparasitaire.
ivAcknowledgements
I would like to thank Pr. Fotis Kafatos for giving me the opportunity to work in his
laboratory, in a scientific environment of very high quality and for his support. It has been (and
still is!) an incredibly exciting time to work in the field of mosquito immunity! Thank you for
having contributed so much to the happening of the mosquito revolution!
I am grateful to Pr. Jules Hoffmann for accepting to be my supervisor in France, and
for his continuous support and interest in my work. Je tenais aussi à vous remercier pour votre
confiance!
Prs. André Capron, Bernard Ehresmann and Dr. Anne Ephrussi accepted to judge my
thesis work and I would like to thank them. Dr. Anne Ephrussi was also a member of my thesis
advisory committee at the EMBL, as well as Dr. Jan Ellenberg. I would like to acknowledge them
for their interest in my work and for their advice.
My deepest gratitude naturally goes to Dr. Elena Levashina, who has been my supervisor.
I would like to thank her for her great support, her humanity and for her fairness. Lena, tu as su me
faire bénéficier de ton expérience et de tes connaissances impressionnantes en toute simplicité, et
c’est une qualité bien rare que j’admire beaucoup. Ton enthousiasme débordant pour la recherche
et pour plein d’autres choses encore, est très communicatif! Merci pour ta bonne humeur! Merci
pour ta confiance qui m’est infiniment précieuse!... Vraiment, je ne saurais comment exprimer
toute ma reconnaissance pour ce que tu m’as donné, et en particulier, pour ton amitié!

This work has greatly benefited from diverse collaborations and I would like to thank
the persons who have been involved in it, one