Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline Chimie par Bénédicte Pons Oligonucléotides Cationiques Synthèse et Evaluation Soutenue publiquement le Mai Membres du jury Directeur de Thèse M Behr Jean Paul Dr Strasbourg Co Directeur de Thèse M Zuber Guy Dr Strasbourg Rapporteur Interne M Winssinger Nicolas Prof Dr Strasbourg Rapporteur Externe M Toulmé Jean Jacques Dr Bordeaux Rapporteur Externe M Kichler Antoine Dr Evry Examinateur M Dumas Philippe Dr Strasbourg

Bénédicte Pons Oligonucléotides

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Chimie par Bénédicte Pons Oligonucléotides Cationiques Synthèse et Evaluation Soutenue publiquement le 24 Mai 2006 Membres du jury Directeur de Thèse : M. Behr Jean-Paul, Dr., Strasbourg Co-Directeur de Thèse : M. Zuber Guy, Dr., Strasbourg Rapporteur Interne : M. Winssinger Nicolas, Prof. Dr., Strasbourg Rapporteur Externe : M. Toulmé Jean-Jacques, Dr., Bordeaux Rapporteur Externe : M. Kichler Antoine, Dr., Evry Examinateur : M. Dumas Philippe, Dr., Strasbourg

• salle du facs


• accès au scanneur de gel de l'igbmc


• laboratoire de chimie génétique de la faculté de pharmacie


• membres du jury directeur de thèse


• rapporteur interne

Sujets

• Oligonucleotide
• Fraley
• Müller
• Antheaume
• Famille Stévenin
• Strasbourg

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 mai 2006
• Nombre de lectures: 145
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 14 Mo

Extrait

Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur Strasbourg I Discipline : Chimie par Bénédicte Pons

Oligonucléotides Cationiques

Synthèse et Evaluation

Soutenue publiquement le 24 Mai 2006

Membres du jury Directeur de Thèse : M. Behr Jean-Paul, Dr., Strasbourg Co-Directeur de Thèse : M. Zuber Guy, Dr., Strasbourg Rapporteur Interne : M. Winssinger Nicolas, Prof. Dr., Strasbourg Rapporteur Externe : M. Toulmé Jean-Jacques, Dr., Bordeaux Rapporteur Externe : M. Kichler Antoine, Dr., Evry Examinateur : M. Dumas Philippe, Dr., Strasbourg

Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé au Laboratoire de Chimie Génétique de la Faculté de Pharmacie de Strasbourg sous la direction des Docteurs Jean- Paul Behr et Guy Zuber. Je tiens tout d’abord à remercier le Dr. Jean-Paul Behr de m’avoir accueillie dans

son laboratoire et de m’avoir accordé sa confiance sur un sujet de recherche ambitieux.

Ces années passées à explorer l’interface chimie-biologie auront été très enrichissantes.

Je veux aussi remercier le Dr Guy Zuber pour la qualité de son encadrement au

quotidien, ses idées scientifiques lumineuses, ses blagues parfois (non, toujours) drôles et

nos longues discussions métachimiques.

Je remercie également le Prof. Nicolas Winssinger ainsi que les Dr. Jean-Jacques Toulmé, Antoine Kichler et Philippe Dumas de m’avoir fait l’honneur de juger ce travail. Mes remerciements vont également à toutes les personnes qui ont participé à

l’étude des oligonucléotides cationiques. En premier lieu Andrew Fraley et Mitsuharu Kotera qui m’ont laissé jouer avec leurs molécules, mais aussi Deniz pour ses photos de microscopie, Marc pour les plasmides et Christian Muller à qui J’accorde une gratitude

éternelle pour ses dépannages express du FACS. Je remercie également Cyril Antheaume

pour son aide en RMN, le Prof. Yves Mély pour m’avoir permis de réaliser mes mesures de

T sur son spectromètre et le Dr. James Stevenin pour m’avoir donné accès au scanneur m de gel de l’IGBMC. Un grand merci aussi à tous ceux sans qui ces années passées à Strasbourg n’auraient pas été les mêmes. Parmi eux, les membres du labo chigen, avec qui j’ai passé de très bons moments aussi bien devant la paillasse qu’autour du café matinal. Je remercie en particulier Liliane pour sa disponibilité et son soutien inconditionnel ainsi que mes deux co-thésardes : Deniz pour la bonne humeur, et Marion pour nos discussions dans

l’ambiance « feutrée » de la salle du FACS ! Merci aussi à tous les amis rencontrés sur le

campus d’Illkirch : Justyna, Vincent, Clémentine, Carla, Cyril et tous ceux que j’oublie. Et

merci enfin à Ben pour sa patience et son aide, notamment dans la chasse aux fautes de frappe. Ce travail a été réalisé grâce au soutien financier de l’Association Française contre les Myopathies et de l’association Naturalia & Biologia.

Table des Matières

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE ................................................................................................................................1

CHAPITRE 1 : L’ADN EN TANT QU’OUTIL.......................................................................................................7

I.U TILISATION DES OLIGONUCLEOTIDES ..........................................9..................................................................... A.Les oligonucléotides outils pour la biologie moléculaire et le diagnostic ...............................................9 1.La PCR........................................................................................................................................................................ 9 2.Les puces à ADN...................................................................................................................................................... 11 B.Les oligonucléotides thérapeutiques : régulation de la synthèse des protéines .....................................13 1.Généralités sur la synthèse des protéines................................................................................................................ 13 2.Reconnaissance des acides nucléiques et régulation de la synthèse des protéines .............................................. 15 3.Ciblage de l’ADN double brin ................................................................................................................................ 17 a)La stratégie Anti-gène ........................................................................................................................................ 17 b)La correction de gènes ....................................................................................................................................... 23 4.Ciblage de l’ARN..................................................................................................................................................... 31 a)Le saut d’exon..................................................................................................................................................... 31 b)La stratégie Antisens .......................................................................................................................................... 33 c)L’ARN interférence............................................................................................................................................ 35 II.L ES OLIGONUCLEOTIDES NATURELS : AVANTAGES ET INCONVENIENTS . ......................................................35 III.L ES OLIGONUCLEOTIDES MODIFIES ...............................................................7.3................................................ A.Les phosphorothioates................................................................................................................................37 B.Les Peptide Nucleic Acids (PNA) ..............................................................................................................39 C...................34................................................................).NA............................ekdLcoLses(LAcideicNucl D.Ajout de charges positives sur l’oligonucléotide .....................................................................................47 1.Bases modifiées par addition de spermine ............................................................................................................. 47 2.Modification des liens internucléosidiques ............................................................................................................ 51 3.Conjugaison de peptides cationiques aux extrémités............................................................................................. 54 E.Transport des oligonucléotides jusqu‘à leur cible ...................................................................................55 IV.N OTRE PROJET ................................65................................................................................................................

CHAPITRE 2 : SYNTHESE DES OLIGONUCLEOTIDES CATIONIQUES. ...............................................57

I.O LIGONUCLEOTIDES CONJUGUES A UNE PEI LINEAIRE . ..................................................................................59 A. ω -HydarizonLP-loéyht................1.......6.......................................................................eniminèly................ B.Conjugaison à l’oligonucléotide : formation d’une liaison hydrazone ..................................................63 1.Introduction d’une fonction aldéhyde sur l’oligonucléotide ................................................................................. 65 2.Formation de la liaison hydrazone .......................................................................................................................... 65 C.Purification et caractérisation du conjugué ODN-PEI ...........................................................................65 II.O LIGONUCLEOTIDES CONJUGUES A UN PEPTIDE LYSINE - ARGININE ...............................................................67 A.................9..6.................................eèssdeptpeesidShtnys...tégé........oiinctaporuqse................................ B.Synthèse des conjugués protégés ...............................................................................................................71 1.Couplage oligonucléotide-SMCC ........................................................................................................................... 71 2.Réaction de conjugaison .......................................................................................................................................... 71 3.Déprotection des conjugués..................................................................................................................................... 73 C.Caractérisation des conjugués par électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant...........73

Table des matières

III.S YNTHESE AUTOMATIQUE D ’ OLIGONUCLEOTIDES - POLYSPERMINES ............................................................77 A.Synthèse de l’amidite spermine..................................................................................................................77 B.Synthèse d’une série d’oligonucléotides-polyspermine ...........................................................................79 C.Caractérisation des ODN-spermine..........................................................................................................81

CHAPITRE 3 : PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES OLIGONUCLEOTIDES CATIONIQUES. ........................................................................................................................................................................................85

I.Q UANTIFICATION DE LA STABILISATION APPORTEE PAR LA QUEUE CATIONIQUE ...........................................87 A.Effet des conjugués ODN-peptide..............................................................................................................89 B.Effet des ODN-spermine ............................................................................................................................91 C.Conclusion sur les propriétés de stabilisation des duplex.......................................................................95 II.E XPERIENCES DE DEPLACEMENT DE BRIN AVEC LES ODN- SPERMINE ...........................................................97 A.Dynamisme de l’appariement de séquences .............................................................................................97 B.Influence de la charge sur l’efficacité du déplacement de brin...............................................................99 C.Effet dose...................................................................................................................................................101 D.Cinétique du déplacement de brin...........................................................................................................101 III.C ONCLUSIONS SUR LES PROPRIETES PHYSICO - CHIMIQUES DES OLIGONUCLEOTIDES CATIONIQUES .........103

CHAPITRE 4 : PROPRIETES BIOLOGIQUES DES OLIGONUCLEOTIDES CATIONIQUES...........107

I.I NTERNALISATION CELLULAIRE ET RECONNAISSANCE ENZYMATIQUE DES ODN- PEPTIDE .........................109 A.Internalisation cellulaire..........................................................................................................................109 B.Reconnaissance enzymatique...................................................................................................................111 II.C ORRECTION DE GENE AVEC LES ODN-PEI .................................................................................................115 A.511........................................................................................pparetro..ru....................................Leèmesyst B.Les séquences d’oligonucléotides testées................................................................................................117 C.Résultats de correction du gène HygEGFP STOP ......................11........9....................................................... 1.Correction épisomale ............................................................................................................................................. 119 2.Correction chromosomale...................................................................................................................................... 125 D.........................1...52................................niorsuisDsscu................................nedtcoiroeralc........e...gèn III.C ONCLUSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................................12..8................

CONCLUSION GENERALE & PERSPECTIVES ............................................................................................129

ABREVIATIONS & SYMBOLES .........................................................................................................................135

MATERIEL&METHODES..................................................................................................................................139

I.I NDICATIONS GENERALES .................141............................................................................................................... II.S YNTHESES CHIMIQUES ................................................................................................................2..41................ A.............142N-tert-butoxycarbonyl-hydrazino-polyethyloxazoline linéaire 140 mère : PEOx-NHNHBoc 1.Synthèse .................................................................................................................................................................. 142 2.Quantification de la réaction de terminaison........................................................................................................ 143 B. ω -Hydrazinopolyéthylènimine linéaire 140 mère : PEI-NHNH 2 ..........................................................143 C.........................................B)SF....ydim(elcusinic.144................................................blneroymeedoztap-F

Table des matières

D.Introduction d’une fonction aldéhyde sur l’oligonucléotide .................................................................144 E.Couplage de l’oligonucléotide à la PEI : formation d’une liaison hydrazone.....................................145 III.C ARACTERISATION DES PROPRIETES DES OLIGONUCLEOTIDES CATIONIQUES . ..........................................146 A.Biologie moléculaire ................................................................................................................................146 1.Electrophorèse ........................................................................................................................................................ 146 a)Gels de polyacrylamide non dénaturants ........................................................................................................ 146 b)Détection de la fluorescence............................................................................................................................ 146 c)Coloration au nitrate d’argent .......................................................................................................................... 146 2.Séquençage du plasmide pEGFPLuc .................................................................................................................... 147 B.Mesure des températures de fusion .........................................................................................................147 1................................................................................................................................... 147Préparation des échantillons 2.Mesure des T m ........................................................................................................................................................ 148 C.Biologie cellulaire ....................................................................................................................................148 1.Généralités .............................................................................................................................................................. 148 2.Correction de gène ................................................................................................................................................. 149 a)Compétition PEI/DOGS................................................................................................................................... 149 b)Correction épisomale ....................................................................................................................................... 149 c)................................................................................................................................ 150Correction chromosomale d)Cytométrie ........................................................................................................................................................ 151

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ..............................................................................................................153

PUBLICATIONS&COMMUNICATIONS........................................................................................................167

Table des matières