UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I

Gabrielle Haas

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I 2007 THESE présentée à la FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE En vue de l'obtention du titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Domaine : Aspects cellulaires et moléculaires de la biologie par Gabrielle HAAS ETUDE DE L'IMPORTATION NUCLEAIRE DE LA PROTEINE P6 DU VIRUS DE LA MOSAIQUE DU CHOU- FLEUR ET DE SON ROLE DANS LA SUPPRESSION DU RNA SILENCING ANTIVIRAL Soutenue publiquement le 30 Novembre 2007 devant la Commission d'Examen : Pr. Mario KELLER Directeur de thèse Pr. Anne-Catherine SCHMIT Rapporteur interne Dr. Stéphane BLANC Rapporteur externe Pr. Thomas HOHN Rapporteur externe Dr. Olivier VOINNET Invité Institut de Biologie Moléculaire des Plantes UPR-CNRS 2357

• induction du rna silencing par l'arn double


• mouvement du signal de silencing dans la défense contre les virus


• p6 en contexte viral


• protéine p6


• importation nucléaire de p6


• bases moléculaires du rna silencing


• rna silencing


• virus p6


• formation des duplexes de srna par les protéines dicer-like


• structure de la particule virale et du génome

Sujets

• Keller
• RNA silencing

Informations

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Extrait

UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
STRASBOURG I
2007



THESE

présentée à la

FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE


En vue de l’obtention du titre de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR

Domaine : Aspects cellulaires et moléculaires de la biologie

par

Gabrielle HAAS



ETUDE DE L’IMPORTATION NUCLEAIRE DE LA
PROTEINE P6 DU VIRUS DE LA MOSAIQUE DU CHOU-
FLEUR ET DE SON ROLE DANS LA SUPPRESSION DU RNA
SILENCING ANTIVIRAL



Soutenue publiquement le 30 Novembre 2007 devant la Commission d’Examen :

Pr. Mario KELLER Directeur de thèse
Pr. Anne-Catherine SCHMIT Rapporteur interne
Dr. Stéphane BLANC Rapporteur externe
Pr. Thomas HOHN Rapporteur externe
Dr. Olivier VOINNET Invité

Institut de Biologie Moléculaire des Plantes
UPR-CNRS 2357











Sommaire
INTRODUCTION GENERALE 6


I Le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) 7
I.1. Structure de la particule virale et du génome 7
I.2. Expression du génome 8
I.2.1 Transcription et épissage alternatif 8
I.2.2 La réplication par transcription inverse 9
I.2.3 La synthèse des protéines virales 10
I.2.3.1. Le saut du ribosome 11
I.2.3.2. La réinitiation de la traduction 12
I.4. La transmission du CaMV 12
I.5. CaMV et pathogenèse 14

II Les protéines du CaMV 15
II.1 Les protéines de mouvements 15
II.2 Les facteurs de la transmission 16
II.3 La protéine de capside 17
II.4 Transcriptase inverse, RNase H et protéinase à acide aspartique 18
II.5 La protéine P6 18
II.5.1 Spécificité d’hôte et symptômes 19
II.5.2 La transactivation traductionnelle 20
II.5.3 Les viroplasmes 22
II.5.4 La protéine P6 est une protéine nucléo-cytoplasmique 24


CHAPITRE I : ETUDE DE L’IMPORTANCE DU TRANSPORT NUCLEO-
CYTOPLASMIQUE ET DES VIROPLASMES DENSES POUR
L’INFECTIVITE DU CaMV

Introduction 26

I Le transport nucléo-cytoplasmique des macromolécules 27
I.1 Le pore nucléaire : structure et généralités 28
I.2 Les signaux d’import-export 29
I.3 L’importation nucléaire des protéines 31
I.3.2 Les importines 31
I.3.1 Mécanisme général de l’importation nucléaire des protéines 32
I.4 L’exportation nucléaire des protéines et des ARN 33
I.4.1 L’exportation nucléaire des protéines 33
I.4.2 L’exportation nucléaire des snARN U 33
I.4.3 L’exportation des sous-unités ribosomiques 34
I.4.4 Les voies d’export des ARN messagers 35
I.4.4 L’exportation des ARNt 36
I.4.4 L’exportation nucléaire des miRNA 37
I.5 La régulation du transport nucléo-cytoplasmique 38

II Les caractéristiques de l’importation nucléaire de la protéine P6 40
II.1 L’importation nucléaire de P6 41
II.1.1 P6 interagit in vitro avec l’importine ! 41
II.1.2 Les protéines L13 et L18 contribuent à l’importation nucléaire de
P6 et à sa localisation nucléolaire 42
II.1.3 Les viroplasmes limitent l’importation nucléaire de P6 43 II.2 Caractérisation des signaux de localisation nucléaire (NLS) 43
II.2.1 Identification d’un NLS basique bipartite 43
II.2.2 Identification d’un NLS non conventionnel 44
II.2.3 Les séquences NLS permettent l’importation nucléaire d’un
rapporteur cytoplasmique 46
II.2.4 Le NLS non conventionnel joue un rôle prépondérant 47
II.2.5 Les NLS de la protéine P6 contribuent à la formation des viroplasmes 48
II.2.6 P6 est probablement importée sous forme de monomère 49
II.2.7 L’importation nucléaire de P6 ne serait pas régulée par sumoylation 51
II.3 Importance du transport nucléo-cytoplasmique de P6 en contexte viral 51
II.3.1 Obtention d’un vecteur viral avec une ORFVI interchangeable 52
II.3.2 L’abolition de l’import est délétère pour la multiplication du virus 52
II.3.3 Le trafic nucléo-cytoplasmique de P6 est essentiel pour l’infectivité
du CaMV 54

III Etude de l’importance des viroplasmes denses pour l’infectivité du CaMV 56

Publication n°1 : 57

Electron-dense Viroplasms of Cauliflower mosaic virus are dispensable for
replication and systemic infection of susceptible plants.


CHAPITRE II : ETUDE DU ROLE DE P6 DANS LA SUPPRESSION
DU SILENCING ANTIVIRALE 72



Introduction 72

I Les bases moléculaires du RNA silencing 72
I.1 Induction du RNA silencing par l’ARN double brin 72
I.2 Formation des duplexes de sRNA par les protéines Dicer-like 73
I.3 Assemblage et activité du complexe RISC 75
I.4 Amplification et RDR 76
I.5 RNA silencing et mouvement à courte et longue distance 76

II Les différentes voies du RNA silencing chez Arabidopsis et leurs fonctions 77
II.1 Transgènes et RNA silencing : IR-PTGS et S-PTGS 78
II.2 Les micro (mi)-RNA 78
II.3 Les trans-acting (ta)-siRNA 79
II.4 Les natural-antisense transcript-derived (nat)-siRNA 80
II.5 Méthylation de l’ADN et repeat-associated (ra)-siRNA 81
II.6 Redondance / competition 82

III Phytovirus et RNA silencing antiviral 83
III.1 Les bases moléculaires du RNA silencing antiviral 85
III.1.1 Les sources d’ARNdb 85
III.1.2 Les DCL impliqués dans le silencing antiviral 86
III.1.3 Le complexe RISC 87
III.1.4 Amplification et mouvement du signal de silencing dans la défense
contre les virus 88
III.1.5 Diversité des modes d’action des suppresseurs du RNA silencing 89 III.2 CaMV et RNA silencing 90

IV Caractéristiques de la suppression du RNA silencing par la protéine P6
du CaMV 91

Publication n°2 : 92

Nuclear import of the Cauliflower mosaic virus P6 protein is mandatory
for viral replication and for suppression of the silencing component DRB4


DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES 105


MATERIEL ET METHODES 115


BIBLIOGRAPHIE 132











Introduction Générale Introduction générale
INTRODUCTION GENERALE

Les phytovirus sont à l’origine de graves difficultés économiques car ils provoquent la
destruction de nombreuses plantes cultivées ou les rendent impropres à la consommation. Composés à
95% de virus à ARN, et plus particulièrement à ARN de polarité positive, il existe cependant trois
familles de phytovirus ayant un génome à ADN : les Geminiviridae, les Nanoviridae et les
Caulimoviridae. Le génome des Geminiviridae est formé d’une ou deux molécules d’ADN circulaire
simple-brin renfermée(s) dans une double-capside icosaédrique jumelée et celui des Nanoviridae, de
plusieurs molécules d’ADN circulaire monocaténaire, chaque molécule étant contenue dans une
capside isométrique. En revanche, l’information génétique des membres de la famille des
Caulimoviridae est portée par une molécule unique d’ADN circulaire double-brin. Cette dernière est
répliquée par la transcription inverse d’un ARN prégénomique et reste sous forme épisomale dans le
noyau de la cellule hôte (quelques cas d’intégration accidentelle dans l’ADN nucléaire ont été décrits
ces dernières années (Staginnus et Richert-Poggeler, 2006). Cette caractéristique a amené les
Caulimoviridae à être classés dans le super-groupe des pararétrovirus, comprenant également les
Hepadnaviridae spécifiques des animaux (Rothnie et al., 1994).
Les virus de la famille des Caulimoviridae ont été classés en six genres par l’ICTV
(International Committee of Taxonomy of Viruses) : les Badnavirus, les Tungrovirus, les Petuvirus, les
Cavemovirus, les Soymovirus et les Caulimovirus. Ils infectent diverses cultures et sont répartis
géographiquement dans les zones tempérées. Cependant, les Tungrovirus et les Badnavirus sont
également présents dans les zones tropicales infectant par exemple, les plantations de riz, de bananiers,
de cacaoyers ou de cannes à sucre.
Les virus des deux premiers genres possèdent une capside balliciforme alors que ceux des