Offre-de-These-PCR electrochimique LEM 2010

Balland

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• Publié par: Idwa
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• Langue: Catalan

Extrait

Proposition de thèse

Sujet :V ERS UNE PCRE LECTROCHIMIQUE EN T EMPS R EEL S URSPECIFIQUE ET M ULTIPLEXEE Mots clefs :Electrochimie, Chimie analytique, Détection d’ADN, Biologie moléculaire Laboratoired’accueil: Laboratoire d’ElectrochimieMoléculaire, UMR CNRS 7591, 15, rue Jean-Antoine de Baïf, 75205 PARIS (http://lemp7.cnrs.fr/) - Directeur : B. Limoges Equipe impliquée : » Approche électrochimique de la réactivité enzymatique et nouvelles méthodologies électroananalytiques » Contacts :Benoit Limoges ([e-mail]- Tél : [phone]) ou Damien Marchal ([e-mail]- Tél : [phone]) Profil ou spécialité recherché: Chimie analytique/Physico-chimie/Sciences del’ingénieur/Biologie moléculaire

Démarrage de la thèse :septembre 2010

Résumé du projet :

L'un des enjeux du diagnostic médical réside dans l’identification et la détection de très faibles quantités d'agents pathogènes (virus, bactéries, parasites, etc…)dans des matrices biologiques complexes. Parmi les nombreuses techniques commerciales qui répondent à cette demande, la méthode de PCR (Polymerase Chain Reaction) est certainement la plus employée. En effet, cette dernière permet d'amplifier par réplication des fragments d'ADN (pouvant par exemple coder pour des cibles pathogènes), avec une efficacité et spécificité redoutable, ce qui permet de détecter indirectement d'infimes quantités d'une cible biologique. La PCR permet ainsi de répliquer spécifiquement, en moins de deux heures, quelques copies d'une séquence cible (ADN, ARN) en plusieurs milliards d'autres. La PCR dites en temps réel, développée au cours des années 90, constitue une amélioration significative. Cette dernière permet en effet de suivre in situ la cinétique complète de la réaction de polymérisation en chaîne et ainsi de visualiser au cours du processus la phase exponentielle à partir de laquelle suffisamment d'ADN est amplifié pour être détecté. Cette stratégie, non seulement permet de s'affranchir d'une détection post-PCR souvent longue et fastidieuse, mais elle autorise également une analyse quantitative relativement précise de l’ADN cible initialement présent dans l'échantillon.A l’heure actuelle, toutes les techniques de PCR en temps réel reposent sur des principes de détection par fluorescence qui nécessitent l'utilisation de réactifs couteux, ainsi qu'un appareillage sophistiqué, relativement encombrant, avec un coût d'acquisition et de maintenance onéreux. Dans le but de développer un appareillage de PCR en temps réel beaucoup moins couteux mais aussi plus facile à miniaturiser, l'équipe du Laboratoire

d’Electrochimie Moléculaire de l'Université Paris Diderot a imaginé deux différents principes de PCR 1-3 en temps réel fondés sur un mode de détection électrochimique.Celui le plus prometteur repose sur la détection d'une sonde redox interagissant avec l’ADN dont la réponse électrochimique, en voltamétrie à vague carrée, évolue de manière exponentielle dès lors que de l’ADN cible double-brins 3 est produit en quantité suffisante au cours des cycles thermiques.Nous avons avec cette méthode pu démontrer des performances analytiques tout à fait comparables aux méthodes commerciales (comme par exemple la PCR temps réel avec sonde fluorescente SYBR Green), mais avec un coût de mise enœuvresignificativement plus faible et la possibilité de développer un système miniaturisé. Le développement de cette méthode, à fort potentiel de valorisation industrielle, a été soutenu financièrement par une ANR en 2006. Le principe de la méthode a également fait l'objet d'un dépôt 3 de brevetet a obtenu le prix Diderot Innovation 2006. L'invention est actuellement en cours de valorisation après avoir été sélectionnée lors du concours national d'aide à la création d'entreprises de technologies innovantes en 2009, dans la catégorie émergence.

Le projet de thèse que nous proposons s’inscrit dans la continuité de ces premiers travaux. La démonstration de faisabilité d'une PCR électrochimique temps réel, nous a permis d'ouvrir un nouveau champ d'investigation à partir duquel de nombreuses améliorations et autres principes de détection électrochimique peuvent être d'ores et déjà envisagés. Nous souhaitons notamment développer une stratégie de détection basée sur l'utilisation d'une sonde spécifique d'hybridation marquée par un groupement redox, de façon à assurer une meilleure spécificité de détection et ainsi répondre pleinement au critère de spécificité requis dans le domaine du diagnostique médical. D'autre part, en cas de succès, il serra possible d'étendre le concept à une détection électrochimique multiplexée de plusieurs sondes oligonucléotidiques marquées par différents groupes redox de potentiels standards distincts.

C'est un projet de thèse qui se veut de nature pluridisciplinaire ou le candidat sera amené à synthétiser et purifier des sondes d'ADN marquées par des groupements redox, à fonctionnaliser la surface d'électrodes par différentes approches, à manipuler les outils de l'électrochimie analytique, et à s'impliquer dans des aspects aussi bien technologiques, que de biologie moléculaire ou encore des problématiques d'analyse biologique.

Travaux récents liés au projet:

1. Real-TimeElectrochemical Monitoring of the Polymerase Chain Reaction by Mediated Redox Catalysis, T. Defever, M. Druet, M. Rochelet-Dequaire, M. Joannes, C. Grossiord, B. Limoges, D. Marchal. J. Am. Chem. Soc.,2009,131, 11433–11441. 2.Méthode d’identification électrochimique de séquences cibles de nucléotides. T. Defever, B. Limoges, D. Marchal, Brevet n° FR2008/03143. 3. Méthodede détection électrochimique de séquences cibles d'acides nucléiques. D. Marchal, B. Limoges, M. Rochelet-Dequaire, Brevet n° FR2006/01936.