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3D fluorescence microscopy with isotropic resolution on the nanoscale [Elektronische Ressource] / put forward by Roman Schmidt

82 pages
Dissertationsubmitted to theCombined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematicsof the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germanyfor the degree ofDoctor of Natural SciencesPut forward byDiplom-Physiker Roman Schmidtborn in Wuppertal, GermanyOral examination: November 5th, 20083D uorescence microscopywith isotropic resolutionon the nanoscaleReferees:Prof. Dr. Stefan W. HellProf. Dr. Christoph CremerKurzdarstellung.Die Au osung eines jeden linearen Abbildungverfahrens ist durch seine Punkt-bildfunktion (engl. point-spread-function, PSF) gegeben, die das Verwascheneines Punktes des Urbilds quanti ziert. Je scharfer die PSF, desto besser dieAu osung. In der herk ommlichen Fluoreszenzmikroskopie weist die PSF beu-gungsbedingt ein zigarrenf ormiges Hauptmaximum auf, welches auch fokalerFleck genannt wird. Seine Ausdehnung betragt mindestens die Halfte derLichtwellenlange ( = 400-800 nm) in der Fokalebene und> entlang der op-tischen Achse (z). Obwohl Konzepte entwickelt wurden, die den fokalen Flecksowohl lateral als auch axial scharfen, ist es bisher keinem von ihnen gelun-gen, das ultimatives Ziel zu erreichen: Die isotrope Abbildung mittels eineskugelf ormigen fokalen Flecks, der beliebig verkleinert werden kann.
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Dissertation submitted to the Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany for the degree of Doctor of Natural Sciences
Put forward by
Diplom-Physiker Roman Schmidt born in Wuppertal, Germany
Oral examination: November 5th, 2008
3D fluorescence microscopy with isotropic resolution on the nanoscale
Referees:
Prof. Dr. Stefan W. Hell Prof. Dr. Christoph Cremer
Kurzdarstellung. Die A fl¨ ng eines jeden linearen Abbildungverfahrens ist durch seine Punkt-u osu bildfunktion (engl. point-spread-function, PSF) gegeben, die das Verwaschen einesPunktesdesUrbildsquantiziert.Jescha¨rferdiePSF,destobesserdie Auo¨sung.Inderherk¨ommlichenFluoreszenzmikroskopieweistdiePSFbeu-gungsbedingteinzigarrenf¨ormigesHauptmaximumauf,welchesauchfokaler Fleckgenanntwird.SeineAusdehnungbetra¨gtmindestensdieH¨alfteder Lichtwellenl¨ e (λ= 400-800 nm) in der Fokalebene und> λentlang der op-ang tischen Achse (z Konzepte entwickelt wurden, die den fokalen Fleck). Obwohl sowohllateralalsauchaxialsch¨arfen,istesbisherkeinemvonihnengelun-gen, das ultimatives Ziel zu erreichen: Die isotrope Abbildung mittels eines kugelformigen fokalen Flecks, der beliebig verkleinert werden kann. Hier stelle ¨ ich solch ein Fluoreszenzmikroskop vor und demonstriere die Erzeugung eines kugelf¨ormigenfokalenFlecksmiteinemDurchmesservon40-45nm(λ/16), der unter geigneten Bedingungen auf 21-30 nm (λ/30) verkleinert wird. Rein auf fokussiertem Licht basierend, blickt dieses linsenbasierte Fluoreszenz-nanoskop in das Innere von Zellen und analysiert nicht-invasiv die Struktur ihrer sub-λ Weiteremessenden Organellen. Anwendungen, wie zum Beispiel dieCharakterisierungneuartigerNanomaterialien,er¨onenneueEinsatzgebiete. Abstract. The resolution of any linear imaging system is given by its point-spread-function (PSF) quantifying the blur of an object point in the image. The sharper the PSF, the better is the resolution. In standard fluorescence microscopy, however, diffraction dictates a PSF with a cigar-shaped main maximum, called the focal spot which extends over at least half the wavelength of light (λ= 400-800 nm) in the focal plane and> λalong the optic axis (z). While concepts have evolved to sharpen the focal spot both laterally and axially, none of them has reached their ultimate goal: a spherical spot that can be arbitrarily downscaled in size. Herein, I introduce such a fluorescence microscope and demonstrate the creation of spherical focal spots of 40-45 nm (λ/16) diameter that is pushed down to 21-30 nm (λ/ Fully relying on focused30) under suitable conditions. light, this lens-based fluorescence nanoscope unravels the interior of cells non-invasively, uniquely dissecting their sub-λsized organelles. Further fields of application open up, such as the characterization of novel nanomaterials.
Contents
1 Introduction 2 A spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells 2.1 Coherence for a sharper image . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1 PSF and OTF of 4Pi microscopy and I5M . . . . . . . 2.2 The I5 . . . . . . . . . . . . . . . .M/4Pi hybrid microscope . 2.2.1 PSF-measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.2 Comparative imaging of biological specimen. . . . . . . 2.2.3 Simulations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Pushing the limits of 4Pi microscopy and I5 . . . . . . . .M . 2.3.1 Objective lenses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2 Sample thickness and recording volume . . . . . . . . 2.4 isoSTED microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1 STED augmented 4Pi microscopy . . . . . . . . . . . 2.4.2 Spherical focal spot generation . . . . . . . . . . . . . 2.4.3 Dual-color 3D nanoscopy imaging . . . . . . . . . . . 2.4.4 isoSTED microscopy with a single depletion beam . . . 2.4.5 Discussion and outlook . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Spotlights on isoSTED application 3.1 Unfolding the blueprint of life . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 The Golgi apparatus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2 Mitochondria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Studies on the architecture of nanomaterials . . . . . . . . . . A Methods B Publications and presentations Bibliography Acknowledgment
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