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AVERTISSEMENT

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LIENS


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http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
Faculté des Sciences- UFR Sciences et Techniques Biologiques

Ecole Doctorale BioSE : Biologie, Santé, Environnement




Thèse

présentée et soutenue publiquement pour l’obtention du titre de

Docteur de l’Université Henri Poincaré

en Sciences de la Vie et de la Santé

par

Luisa LAURETI

Activation of a silent type I polyketide synthase gene cluster in
Streptomyces ambofaciens ATCC23877: isolation and
characterization of a novel giant macrolide

Activation d’un cluster de gènes de polycétide synthase de type I
chez Streptomyces ambofaciens ATCC23877 : isolation et
caractérisation d’un nouveau macrolide géant




Soutenance publique prévue le 7 janvier 2010 devant la commission d’examen :


Membres du jury :

Rapporteurs : M. Mervyn BIBB Professeur, John Innes Center, Norwich
M. Jean-Luc PERNODET Directeur de Recherche CNRS, Université Orsay

Examinateurs : M. Frédéric BOURGAUD Professeur, Nancy-Université
M. Bernard DECARIS ancy
M. Pierre LEBLOND ancy-Université (Directeur de thèse)
M. Bertrand AIGLE Maître de Conférences, Nancy-Université


Laboratoire de Génétique et Microbiologie UMR INRA-UHP 1128
Faculté des Sciences et Techniques – 54506 Vandœuvre-lès-Nancy





















































The Fishermen know that the sea is dangerous and the storm terrible,
but they have never found these dangers sufficient reason for remaining ashore.
(Vincent van Gogh)





































ACKNOWLEDGEMENTS/REMERCIEMENTS


Je remercie le Professeur Pierre Leblond pour m’avoir accueillie au sein du Laboratoire de
Génétique et Microbiologie et pour m’avoir permis d’entreprendre cette thèse.

I would like to thank Professor Mervyn Bibb and Professor Jean-Luc Pernodet for accepting
to be my referees. For me it has been a great honour and I hope for them it will be a pleasure to
read this thesis.

Je voudrais aussi remercier le Professeur Frédéric Bourgaud et le Professeur Bernard Decaris
pour avoir accepté d’être mes examinateurs.

I would like to thank Professor Greg Challis and the Dr Lijiang Song and Dr Christophe
Corre for welcoming me in the lab and for all the precious help in the discovery and the
characterization of sambomycin, our “little baby”. I really learned a lot from them and I enjoyed
my staying in England very much.

Je tiens surtout à remercier mon “dear boss” ( ☺) le Docteur Bertrand Aigle qui a toujours cru
en moi et dans ce projet, même quand moi je n’y croyais plus ! Merci pour la confiance que tu
m’as accordée tout au long de cette thèse et pour tous tes conseils professionnels, mais aussi
personnels. Merci d’avoir accepté mon « sacré caractère » de petite Calimero et d’avoir été
toujours très compréhensible et disponible avec moi ! J’ai beaucoup appris de toi. Ton
enthousiasme et ta rigueur scientifique resteront toujours un exemple pour moi. Enfin, travailler
côte à côte avec toi a été un vrai plaisir et je sais que tout ça va beaucoup me manquer.

Cette thèse n’aurait jamais été achevée sans l’aide et le soutien de toutes les personnes que j’ai
eu la chance de rencontrer à Nancy et de celles qui faisaient déjà partie de ma vie. Je suis
devenue celle que je suis aussi grâce à eux !

Tout d’abord, je tiens à remercier de tout mon coeur l’équipe Streptomyces ☺ :
Laurence, pour sa gentillesse infinie et pour tous les petits moments de bonheur et de pause thé
partagés avec moi. Je me suis sentie en famille avec toi, Christophe et les enfants ! Robert, un
grand merci à toi pour ton aide à la paillasse et pour ta patience à répondre à mes questions et à
mes doutes. Un grand merci également pour avoir été mon partenaire de badminton et de danse,
on s’est beaucoup éclatés ensemble. Sans toi le labo n’a plus été pareil ! Merci à Caths, toujours
pleine de bonne humeur, d’énergie et toujours disponible envers les autres… promets-moi
d’apprendre à dire non de temps en temps ! ;-) Thanks a lot to Isolde, the other foreign English
speaking in the lab ! Even if we met at the end of this adventure, we had the chance to share a

lot of nice and funny moments and I wish you all the best for your future! Merci à Annabelle,
pour son accueil chaleureux et pour son aide à chercher mon petit coin douillet, sans même me
connaître auparavant ! Merci pour m’avoir laissée faire du babysitter au petit Daniel, j’ai
vraiment aimé !

Je tiens aussi à remercier toutes les autres personnes du laboratoire présentes, passées ou venant
juste d’arriver, avec qui j’ai eu le plaisir de partager ces trois années de thèse et qui m’ont
permis de ne pas trop sentir la solitude et la distance avec mon pays et mes proches.
En particulier, merci à Catherine, Virginie, Séverine, Céline, Xavier et Stéphane pour toutes
les petites soirées gourmandes et arrosées passées ensemble. Merci à mes « collègues » thésards
Nico, Ludo et Romain à qui je souhaite très bon courage ! Merci aux « petits » du labo (comme
je les appelle amicalement) Julien, Aurore, Emilie, Fabien, Justine et Maxime car ils
contribuent à rendre le labo très sympa et rigolo! Merci à Sophie pour son super talent
d’organisation ! Merci enfin à Fred et Julie, mes deux amis en dehors du labo, avec qui j’ai
passé des moments très sympas, oubliant pour quelques heures mon boulot !

A special thank to my dear friend Bjørn, who has always been there for me for better or for
worse, even being across the ocean as proof that nothing can ruin our friendship! Thank you
very much for reading and correcting my manuscript, you gave me very useful advices and
comments, but most of all you always encouraged me in my work because you know how silly I
can be when an experiment doesn’t work as I want!! Waar ik ook heen zal gaan, ik zal je altijd
in mijn hart dragen.

Un grazie infinito ai miei cari amici italiani Gi, Valentina e Laura che sono sempre riusciti a
infondermi coraggio e fiducia e che per dimostrarmi il loro affetto sono venuti fino a Nancy! ☺

E infine voglio ringraziare la mia famiglia che mi ha sostenuto per tutto questi anni, standomi
sempre vicino e facendomi sentire il loro affetto incondizionato. Se sono quella che sono, lo
devo soprattutto a voi e all’esempio di amore, rispetto, altruismo e professionalità che mi avete
sempre dato.








INDEX

ABBREVIATIONS__________________________________________________________________1
INTRODUCTION__________________________________________________________________ 3
1. General context___________________________________________________________________5
2. Secondary metabolism and microbial natural products__________________________________7
2.1 Interconnection between primary and secondary metabolism_______________________________ 9
2.2 The antibiotics___________________________________________________________________10
2.3 Mechanisms of bacterial resistance___________________________________________________12
2.3.1 Active-efflux pumps______________________________________________________ 12
2.3.2 Enzymatic inactivation of the antibiotic_______________________________________ 13
2.3.3 Modification of the target site _______________________________________________13
3. Strategies to discover novel natural bioactive molecules_________________________________14
3.1 Genome mining __________________________________________________________________15
3.1.1 OSMAC approach ________________________________________________________16
3.1.2 Genomisotopic approach ___________________________________________________16
3.1.3 Gene inactivation and comparative metabolic profiling approach ___________________17
3.1.4 Heterologous expression ___________________________________________________18
3.1.5 Modification of the regulatory network________________________________________19
3.2 Metagenomics ___________________________________________________________________20
3.3 Combinatorial biosynthesis _________________________________________________________21
3.4 Screening of rare genera of actinomycetes and other untapped sources_______________________22
4. Insights in the regulation of secondary metabolism_____________________________________24
4.1 Nutritional regulation______________________________________________________________24
4.2 Global regulation_________________________________________________________________26
4.3Extracellular signals _______________________________________________________________28
4.3.1 γ-butyrolactones__________________________________________________________28
4.3.2 Furans__________________________________________________________________30
4.3.3 PI factor ________________________________________________________________31
4.4 Pathway-specific regulators_________________________________________________________31
4.4.1 SARP regulators__________________________________________________________31
4.4.2 LAL regulators___________________________________________________________32
5. Polyketide synthases versus non-ribosomal peptide synthases ____________________________33
5.1 The core domains_________________________________________________________________34
5.2 The auxiliary domains _____________________________________________________________35
5.3 The initiation and termination domains________________________________________________36
5.3.1 Type II thioesterase _______________________________________________________37
6. Polyketide synthases______________________________________________________________38

6.1 Typology of polyketide synthases____________________________________________________38
6.1.1 Modular type I PKS_______________________________________________________38
6.1.2 Iterative type I PKS _______________________________________________________39
6.1.3 Type II PKS_____________________________________________________________39
6.1.4 Type III PKS ____________________________________________________________40
6.2 Polyketide-tailoring genes__________________________________________________________41
6.2.1 Glycosyltransferases ______________________________________________________41
6.2.2 Methyltransferases and oxygenases_____________________42
7. Streptomyces, a prolific producing genus______________________________________________43
7.1 General characteristics_____________________________________________________________43
7.2 Streptomyces ambofaciens__________________________________________________________44
8. Objectives of the thesis ____________________________________________________________47

RESULTS_________________________________________________________________________49
Chapter 1 In silico characterization of a large type I PKS cluster ___________________________51
1.1 Sequence analysis of the enzymatic domains ___________________________________________54
1.1.1 Ketosynthase domains_____________________________________________________54
1.1.2 Acyl transferase domains___________________________________________________55
1.1.3 Acyl carrier protein domains________________________________________________56
1.1.4 Ketoreductase domains______________________________ 56
1.1.5 Dehydratase domains______________________________________________________58
1.1.6 Enoyl reductase domains_____________________________58
1.1.7 Thioesterase domain ______________________________________________________59
1.2 Prediction of the linear polyketide structure ____________________________________________60
1.3 Analysis of the other genes putatively involved in the biosynthesis__________________________62
1.3.1 Glycosyltransferase and sugar genes__________________________________________62
1.3.2 Cytochrome P450_________________________________________________________63
1.3.3 Thioesterase type II _______________________________________________________64
1.3.4 Additional genes _________________________________________________________64
1.4 The resistance genes ______________________________________________________________65
1.5 The regulatory genes ______________________________________________________________65
1.5.1 A two component system___________________________________________________65
1.5.2 A LAL regulator__________________________________________________________66
Chapter 2 Activation of a silent cluster and isolation of a novel bioactive macrolide of Streptomyces
ambofaciens ATCC2387771 __________________________________________________________69
2.1 Activation of a silent cluster ________________________________________________________70
2.2 Detection and isolation of a novel metabolite ___________________________________________72
2.3 The detected metabolites are synthetised by the type I PKS cluster _________________________ 73

2.4 Structural elucidation of the novel compounds__________________________________________75
2.5 Biological properties of the macrolide sambomycin______________________________________77
Article: Discovery of a novel macrolide in Streptomyces ambofaciens by awaking a sleeping giant ___79
Chapter 3 Characterization of sambomycin biosynthesis __________________________________99
3.1 Limits of the sambomycin cluster ____________________________________________________99
3.2 The phosphopantetheinyl transferase_________________________________________________100
3.3 The cytochromes P450____________________________________________________________101
3.4 The acyl-CoA synthetase and the acyl-CoA carboxylase _________________________________105
3.5 Secretion of sambomycin__________________________________________________________106
3.6 The resistance genes _____________________________________________________________110
Chapter 4 Regulation of the sambomycin cluster________________________________________113
4.1 The LAL regulator is an activator of the sambomycin gene cluster _________________________113
4.2 Searching for the targets of the LAL regulator _________________________________________115
4.3 In vitro characterization of the LAL regulator__________________________________________117
4.4 Sambomycin production in R2 medium ______________________________________________120
4.5 Effect of SAMR0484 on spiramycin production________________________________________122
4.6 The two component system________________________________________________________125

CONCLUSION AND PERSPECTIVES_______________________________________________ 127
1. Sambomycin, a peculiar 50-membered macrolide __________________________________128
1.1 A new cyclization mechanism for polyketides _________________________________________128
1.2 Biosynthesis of an unusual extender unit______________________________________________130
1.3 Glycosylation of the sambomycin aglycones __________________________________________134
2. Macrolides: biological properties and resistance mechanisms___________________________ 135
2.1 Biological properties_____________________________________________________________ 135
2.2 Resistance mechanisms___________________________________________________________ 136
3. The LAL regulator is a positive pathway-specific regulator of the sambomycin cluster______136
4. Combinatorial biosynthesis of the sambomycin gene cluster ____________________________139
5. The role of sambomycin in nature__________________________________________________ 140
6. Streptomyces ambofaciens and its fascinating secondary metabolites______________________142

APPENDIX_______________________________________________________________________145
REFERENCES____________________________________________________________________159