Activités cytotoxiques et pro-oxydantes d'acides gras à très longue chaîne sur des oligodendrocytes murins sauvages et déficients en Abcd1 et Acox1 : application à la physiopathologie de l'X-ALD et de la P-NALD, Cytotoxic and pro-oxydant effects of very long chain fatty acids on glial cells and their implications for X-ALD and P-NALD diseases

Mauhamad Baarine

Description

Sous la direction de Gérard Lizard
Thèse soutenue le 15 décembre 2010: Dijon
L’X-ALD et la P-NALD sont deux maladies peroxysomales, métaboliques et neurodégénératives rares. L'X-ALD et la P-NALD résultent de déficiences respectives en ABCD1 et ACOX1. Ces deux maladies dans leurs formes sévères sont associées à des phénomènes de démyélinisation inflammatoire du SNC. Au niveau des lésions, des signes d'oxydation et une mort cellulaire sont observés. L’accumulation des AGTLC plasmatiques et tissulaires est le critère biochimique commun à ces deux maladies. Dans un premier temps, nous avons caractérisé une lignée d'oligodendrocytes murins 158N afin de l'utiliser comme modèle. Cette lignée qui présente des caractéristiques d'oligodendrocytes matures (expression des protéines de myéline MOG, MBP, PLP) possède aussi des peroxysomes fonctionnels possédant les protéines Abcd1 et Acox1. Ensuite, nous avons étudié les effets cytotoxiques et pro-oxydants des AGTLC (C24:0 et C26:0), ainsi que l’incidence de l’extinction d’Abcd1 et d’Acox1 par siRNA sur l'équilibre RedOx et la mort cellulaire. Les effets des AGTLC sur les caractéristiques biophysiques de la membrane cytoplasmique ont aussi été abordés. Par ailleurs, des marqueurs du stress oxydant ont été recherchés sur des plasmas des patients atteints de différentes formes d’X-ALD. In vitro, nous avons montré que l’accumulation d'AGTLC dans les cellules 158N induit une surproduction d'espèces radicalaires de l'oxygène et de l'azote et une perturbation des défenses anti-oxydantes (catalase, SOD, GSH). Ceci s'accompagne d'une peroxydation lipidique, d'une carbonylation des protéines et d'une dégradation de l'ADN. L'extinction d'Abcd1 et d'Acox1 par des siRNA augmente la production d'espèces radicalaires et potentialise le stress oxydant induit par les AGTLC. Sur les plasmas de patients atteints de différentes formes d’X-ALD, comparativement à des sujets sains, nous avons montré l’accumulation des produits de peroxydation lipidiques (7-hydroxycholestérols, HODEs). Le taux de ces deux produits est corrélé avec la sévérité de la maladie: CCALD>AMN>Addison>ACALD. Les AGTLC induisent aussi la mort des cellules 158N par un processus non apoptotique. Cette mort cellulaire est caractérisée par: une perturbation rapide du calcium intracellulaire, une diminution du pH, une chute du potentiel transmembranaire mitochondrial associée à des modifications structurales des mitochondries, une déstabilisation des lysosomes et une formation de figures d'autophagie. Les AGTLC perturbent aussi la fluidité membranaire. Par ailleurs, les AGTLC n'affectent pas l'expression des protéines majeures de la myéline PLP et MBP. Ces travaux ont mis en évidence un lien direct entre l'accumulation des AGTLC, le stress oxydant et l'induction de mort cellulaire faisant intervenir les lysosomes. La déficience en Abcd1 et Acox1 favorise le stress oxydant. En accord avec les résultats obtenus in vitro, la mise en évidence de marqueurs de peroxydation lipidiques dans le plasma de malades atteints d'X-ALD conforte l'hypothèse d'une intervention du stress oxydant dans cette pathologie.
-Peroxysome
-X-ALD
-P-NALD
-Oligodendrocytes
-Mort cellulaire
-Stress oxydant
-Protéines de myéline
-Lysosome
X-ALD and P-NALD are two rare, peroxisomal metabolic and neurodegenerative diseases. ABCD1 and ACOX1 are known to be responsible for X-ALD and P-NALD, respectively. The actively demyelinating lesions in CNS, exhibited signs of oxidative stress and cell death. The accumulation of VLCFA in plasma and tissue is the biochemical common hallmark to both diseases. First, we characterized a murine oligodendrocytes cell line 158N to use it as a model. This 158N cell line which has characteristics of mature oligodendrocytes (expression of myelin proteins MOG, MBP, PLP), has also functional peroxisomes with Abcd1 and Acox1 proteins. Then, we studied the cytotoxic and pro-oxidative effects of VLCFA (C24: 0 and C26: 0), and the effects of in vitro silencing of the Abcd1 and Acox1 genes by siRNA on the redox balance and cell death. Effects of VLCFA on the biophysical characteristics of cytoplasmic membrane were also evaluated. Moreover, markers of oxidative stress were researched on plasma of patients with different forms of X-ALD. In vitro, we showed that the accumulation of VLCFA on 158N cells induced overproduction of reactive oxygen and nitrogen species and a disruption of antioxidant defense systems (catalase, SOD, GSH). This was accompanied by lipid peroxidation, protein carbonylation and degradation of DNA. The extinction of Abcd1 and Acox1 by siRNA increased the production of radical species and potentialized the oxidative stress induced by VLCFA. On plasma of patients with different forms X-ALD, compared to healthy subjects, we showed an accumulation of lipid peroxidation products (7-hydroxycholesterol, HODEs). The rate of these two products is correlated with the severity of the disease: CCALD> AMN> Addison> ACALD. The VLCFA also induce cell death on 158N by a non-apoptotic process. This cell death is characterized by: a rapid increased of intracellular Ca2+ level, pH decrease, a loss of mitochondrial transmembrane potential associated with structural changes of mitochondria, a destabilization of lysosomes, and formation of autophagic vacuoles. The VLCFA also disrupt the membrane fluidity. Furthermore, VLCFA do not affect the expression of myelin major proteins PLP and MBP. This work highlighted a direct link between VLCFA accumulation, oxidative stress and induction of cell death involving lysosomes. Abcd1 and Acox1 deficiency promotes oxidative stress. In agreement with results obtained in vitro, the detection of markers of lipid peroxidation in the plasma of X-ALD patients favors the hypothesis of an involvement of oxidative stress in this pathology.
Source: http://www.theses.fr/2010DIJOS047/document

Sujets

• Peroxysome
• Mort cellulaire
• Stress oxydant

Informations

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• Poids de l'ouvrage: 19 Mo

Extrait

UNIVERSITE DE BOURGOGNE
ECOLE DOCTORALE ENVIRONNEMENT – SANTE/STIC
THÈSE


Pour obtenir le grade de


Docteur de l’Université de Bourgogne


Discipline : Biochimie, Biologie Cellulaire et Moléculaire
Présentation et soutenance publiques par :
Mauhamad Baarine
15 Décembre 2010
Activités cytotoxiques et pro-oxydantes d'acides gras à très longue chaîne sur des
oligodendrocytes murins sauvages et déficients en Abcd1 et Acox1 : application à la
physiopathologie de l'X-ALD et de la P-NALD.

Directeur de thèse : Gérard Lizard
Membres du Jury :

Mme Nathalie Cartier, DR Inserm U745 - Université Paris Descartes (Paris 5) Rapporteur
M. Saïd Ghandour, DR CNRS, LINC-IFR 37 - Université de Strasbourg Rapporteur
M. Charbel Massaad, Pr CNRS UMR 8194 - Université Paris Descartes (Paris 5) Examinateur
M. Mustapha Cherkaoui-Malki, Pr Inserm U866 - Université de Bourgogne Examinateur
M. Gérard Lizard, CR Inserm U866 - Université de Bourgogne Directeur de thèse





Qu’il me soit permis de remercier :


Les Docteurs Nathalie Cartier et Saïd Ghandour qui ont accepté de bien vouloir lire et
évaluer ce travail. Qu’ils soient assurés de mfoan dper oreconnaissance,

Messieurs les Professeurs Charbel Massaad et Mustapha Cherkaoui-Malki pour avoir
accepté d’examiner ce travail,

Monsieur le Professeur Patrick Aubourg pour avoir fourni les échantillons biologiques
(plasmas de patients atteints de l’X-ALD),

Mesdames Anne Athias et Christine Arnould pour leur assistance technique (analyse
lipidique et microscopie confocale),

Messieurs André Bouchot et Franck Ménetrie r pour leur assistance technique (vidéo-
Microscopie et Microscopie électronique à transmioinss),

Monsieur le Professeur Norbert Latruffe pour m’avoir accueilli dans son laboratoire,

Monsieur le Docteur Gérard Lizard de m’avoir accueilli dans son équipe et d’avoir
supervisé ces travaux.

Mes remerciements vont également à tous les mem dbree sl'équipe 'Biochimie Métabolique
et Nutritionnelle' qui m'ont accompagné au quno tdidaines mon travail de Thèse :

Stéphane Savary, Doriane Trompier, Valérie Nic oSltaésp,hane Mandard, Pierre Andreoletti
(Merci pour la mesure de l'activité Acox1, .C.a.ta)la.s e

Flore, Fred (arrête de toucher partout !!M),a nuJu l:ie ,( collègues du bureau), Hammam,
Kévin, Ségolène, Didier, Emeric (toi alorss !b!es!oi!n td’a’une bonne correction), Virginie
ou chromosome 28 (salsa ! salsa !), Jacqueosn n(aisle) , poAlllan, Zilal, Thomas (le
nouveau).

Et enfin à Nathalie Bancod (Mme Bancod) : Nréottariere sesic aimable, si rigolote (je sais
que j’étais parfois lourd mais c’est toujours dans le bon☺ s)e n s

Qu'ils trouvent ici mes sincères remerciements.



J’aimerais également remercier tous les amis de Dijon :

Maher ou hamidaaaa (Dr 3ala nafask), café des cdauféc sd,roits-letrre,Hâagen-dazs……oufffffff

Samer (pipo), celui qui n’arrête jamais alors sj admea iparler

Houssein nasrallah (oh lala …..Nos folles soniroése sm, atchs de foot où on s’engueule tout le temps
… que de bons souvenirs)

Jack hindieh ou jaco ou encore drink machin (nl’diralias)

Chadi dit il lembi

Toni abi habi : le canadien

Ahmad youssif (le grec) dit houbi wa hanani

Bilal abou cha3ar : il belgiqui

Jalal il 2awi wal batal

Omar kobani : le plus mauvais joueur de foot qnu’ea i jejamais vu

Bechara al bouna ou bach (mon voisin et mon sumpiegro )a

Alawiyi : ya kabir, mon collègue de l’ESC de Deti jocnol,lègue de la pose café entre midi et deux

Cosette: Sadikati al 3akariyi WA oustazat al laolu3gahr abiya☺

Roy : la2 PLeaz wati sawtak

Ouaiss : ami de Lyon

Stéphane : je pourrai dire qu’après 6 ans à D’aiij onu nj vrai ami frança☺is

Guillaume et Ludiwine : mes amis les méditerran,é enles soirées, la piscine,… que de bons souvenirs

Grand merci à tous les autres que je n’ai past epru… c i

Je n’oublie pas non plus mes parents, mes frè rseœs uerts et toute ma famille pour leur soutien moral
et financier.






















A ma mère
A mon père
A ma famille



Résumé

L’X-ALD et la P-NALD sont deux maladies peroxysomales, métaboliques et neurodégénératives
rares. L'X-ALD et la P-NALD résultent de déficiences respectives en ABCD1 et ACOX1. Ces deux
maladies dans leurs formes sévères sont associées à des phénomènes de démyélinisation
inflammatoire du SNC. Au niveau des lésions, des signes d'oxydation et une mort cellulaire sont
observés. L’accumulation des AGTLC plasmatiques et tissulaires est le critère biochimique commun
à ces deux maladies.

Dans un premier temps, nous avons caractérisé une lignée d'oligodendrocytes murins 158N afin de
l'utiliser comme modèle. Cette lignée qui présente des caractéristiques d'oligodendrocytes matures
(expression des protéines de myéline MOG, MBP, PLP) possède aussi des peroxysomes fonctionnels
possédant les protéines Abcd1 et Acox1. Ensuite, nous avons étudié les effets cytotoxiques et pro-
oxydants des AGTLC (C24:0 et C26:0), ainsi que l’incidence de l’extinction d’Abcd1 et d’Acox1 par
siRNA sur l'équilibre RedOx et la mort cellulaire. Les effets des AGTLC sur les caractéristiques
biophysiques de la membrane cytoplasmique ont aussi été abordés. Par ailleurs, des marqueurs du
stress oxydant ont été recherchés sur des plasmas des patients atteints de différentes formes d’X-
ALD.

In vitro, nous avons montré que l’accumulation d'AGTLC dans les cellules 158N induit une
surproduction d'espèces radicalaires de l'oxygène et de l'azote et une perturbation des défenses anti-
oxydantes (catalase, SOD, GSH). Ceci s'accompagne d'une peroxydation lipidique, d'une
carbonylation des protéines et d'une dégradation de l'ADN. L'extinction d'Abcd1 et d'Acox1 par des
siRNA augmente la production d'espèces radicalaires et potentialise le stress oxydant induit par les
AGTLC. Sur les plasmas de patients atteints de différentes formes d’X-ALD, comparativement à des
sujets sains, nous avons montré l’accumulation des produits de peroxydation lipidiques (7-
hydroxycholestérols, HODEs). Le taux de ces deux produits est corrélé avec la sévérité de la
maladie: CCALD>AMN>Addison>ACALD.

Les AGTLC induisent aussi la mort des cellules 158N par un processus non apoptotique. Cette mort
cellulaire est caractérisée par: une perturbation rapide du calcium intracellulaire, une diminution du
pH, une chute du potentiel transmembranaire mitochondrial associée à des modifications structurales
des mitochondries, une déstabilisation des lysosomes et une formation de figures d'autophagie. Les
AGTLC perturbent aussi la fluidité membranaire. Par ailleurs, les AGTLC n'affectent pas
l'expression des protéines majeures de la myéline PLP et MBP.

Ces travaux ont mis en évidence un lien direct entre l'accumulation des AGTLC, le stress oxydant et
l'induction de mort cellulaire faisant intervenir les lysosomes. La déficience en Abcd1 et Acox1
favorise le stress oxydant. En accord avec les résultats obtenus in vitro, la mise en évidence de
marqueurs de peroxydation lipidiques dans le plasma de malades atteints d'X-ALD conforte
l'hypothèse d'une intervention du stress oxydant dans cette pathologie.


Mots-clés : Peroxysome, X-ALD, P-NALD, oligodendrocytes 158N, AGTLC, mort cellulaire, stress
oxydant, protéines de myéline, siRNA, lysosome.





Abstract

X-ALD and P-NALD are two rare, peroxisomal metabolic and neurodegenerative diseases. ABCD1
and ACOX1 are known to be responsible for X-ALD and P-NALD, respectively. The actively
demyelinating lesions in CNS, exhibited signs of oxidative stress and cell death. The accumulation of
VLCFA in plasma and tissue is the biochemical common hallmark to both diseases.

First, we characterized a murine oligodendrocytes cell line 158N to use it as a model. This 158N cell
line which has characteristics of mature oligodendrocytes (expression of myelin proteins MOG,
MBP, PLP), has also functional peroxisomes