An anti-CD30 immunocytokine with combined IL-2 and IL-12 domains enhances anti-tumour immunity [Elektronische Ressource] / Martin Zuther. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
198 pages
Deutsch

An anti-CD30 immunocytokine with combined IL-2 and IL-12 domains enhances anti-tumour immunity [Elektronische Ressource] / Martin Zuther. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät

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An anti CD30 immunocytokinewith combined IL 2 and IL 12 domainsenhances anti tumour immunityDissertationzurErlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)derMathematisch Naturwissenschaftlichen FakultätderRheinischen Friedrich Wilhelms Universität Bonnvorgelegt vonMartin ZutherausHamburgBonn im Oktober 2009Bibliografische Information der Deutschen NationalbibliothekDie Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet überhttp://dnb.d-nb.de abrufbar.ISBN 978-3-86853-433-7Angefertigt mit Genehmigung derMathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultätder Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn1. Gutachter: Prof. Dr. Hinrich AbkenLabor für TumorgenetikUniklinik Köln2. Gutachter: Prof. Dr. Klaus MohrPharmakologie und ToxikologieRheinische Friedrich-Wilhelms-Universität BonnTag der Promotion: 19. März 2010Cover photograph used with kind permission of André Karwath.© Verlag Dr. Hut, München 2010Sternstr. 18, 80538 MünchenTel.: 089/66060798www.dr.hut-verlag.deDie Informationen in diesem Buch wurden mit großer Sorgfalt erarbeitet. Dennoch können Fehler nicht vollständig ausgeschlossen werden. Verlag, Autoren und ggf. Übersetzer übernehmen keine juristische Verantwortung oder irgendeine Haftung für eventuell verbliebene fehlerhafte Angaben und deren Folgen.

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Publié le 01 janvier 2010
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Langue Deutsch
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An anti CD30 immunocytokine
with combined IL 2 and IL 12 domains
enhances anti tumour immunity
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Rheinischen Friedrich Wilhelms Universität Bonn
vorgelegt von
Martin Zuther
aus
Hamburg
Bonn im Oktober 2009Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek
Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über
http://dnb.d-nb.de abrufbar.
ISBN 978-3-86853-433-7
Angefertigt mit Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
1. Gutachter: Prof. Dr. Hinrich Abken
Labor für Tumorgenetik
Uniklinik Köln
2. Gutachter: Prof. Dr. Klaus Mohr
Pharmakologie und Toxikologie
Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Tag der Promotion: 19. März 2010
Cover photograph used with kind permission of André Karwath.
© Verlag Dr. Hut, München 2010
Sternstr. 18, 80538 München
Tel.: 089/66060798
www.dr.hut-verlag.de
Die Informationen in diesem Buch wurden mit großer Sorgfalt erarbeitet. Dennoch können Fehler nicht vollständig ausgeschlossen
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Alle Rechte, auch die des auszugsweisen Nachdrucks, der Vervielfältigung und Verbreitung in besonderen Verfahren wie
fotomechanischer Nachdruck, Fotokopie, Mikrokopie, elektronische Datenaufzeichnung einschließlich Speicherung und
Übertragung auf weitere Datenträger sowie Übersetzung in andere Sprachen, behält sich der Autor vor.
1. Auflage 2010See first, think later, then test.
But always see first.
Otherwise you will only see
What you were expecting.
(Douglas Adams)
Meinen Eltern.Contents
1 Introduction 1
1.1 Classical Hodgkin’s lymphoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Cytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Immunocytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.4 Objectives of this study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2 Materials 9
2.1 Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2 Solutions, media and buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3 Sterilisation procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.4 DNA plasmids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.5 Synthetic oligonucleotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.6 Bacterial strains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.7 Primary cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.8 Cell lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.9 Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.10 Sera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.11 Recombinant proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.12 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3 Methods 25
3.1 Bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.1.1 Bacteria culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.1.2 Generation of chemically competent bacteria . . . . . 26
3.1.3 Transformation by heat-pulse . . . . . . . . . . . . . . 26
3.2 Plasmid DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2.1 Preparation of plasmid DNA . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2.2 Quantification of DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2.3 Ethanol precipitation of DNA . . . . . . . . . . . . . . . 27
vContents
3.2.4 Agarose gel electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2.5 Isolation of DNA from agarose gels . . . . . . . . . . . 28
3.2.6 Digestion of DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2.7 Ligation of DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.2.8 Polymerase chain reaction . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.2.9 Colony PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2.10 Dideoxy DNA sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.3 Tissue culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.3.1 Mammalian tissue culture . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.3.2 Insect tissue culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.3.3 Passage of adherent cells . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.3.4 Passage of cells growing in suspension . . . . . . . . . 33
3.3.5 Subcloning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.3.6 Cryoconservation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.3.7 Calcium phosphate co precipitation of DNA . . . . . . 33
3.3.8 Lipofection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.3.9 Selection of stably transfected cells . . . . . . . . . . . 36
3.3.10 FibraStage™ bioreactor . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.3.11 Isolation of PBMCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3.12 Magnetic cell separation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.4 Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.4.1 Preparation of affinity chromatography media . . . . . 41
3.4.2 Affinity chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.4.3 Quantification of proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4.4 Radiolabelling of immunocytokines . . . . . . . . . . . 44
3.4.5 Thin layer chromatography of radiolabelled immuno
cytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.4.6 Desalting of radiolabelled immunocytokines . . . . . . 46
3.4.7 Affinity chromatography of radiolabelled immunocy-
tokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.5 Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.5.1 Enzyme linked immunosorbent assay . . . . . . . . . 47
3.5.2 Binding inhibition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.5.3 Radioimmunoassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.5.4 Immunofluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.5.5 Proliferation of PBMCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.5.6 Cytolysis of tumour cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
viContents
3.5.7 Phosphorylation of STAT4 . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.6 Experiments on mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.6.1 Biodistribution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.6.2 Tumour growth in mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.6.3 Serum samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.7 Statistics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4 Results 59
4.1 Immunocytokines are expressed in insect cells . . . . . . . . 59
4.1.1 Generation of the plasmid pBullet HRS3scFv CD3 ‡
(#1078) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.1.2 Generation of the plasmid pMT/BiP HRS3scFv Fc
(#1082) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.1.3 Generation of the plasmid pMT/BiP HRS3scFv Fc hi
IL12 (#1083) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4.1.4 Generation of the plasmid pMT/BiP HRS3scFv Fc IL2
(#1086) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4.1.5 Generation of the plasmid pMT/BiP HRS3scFv hi
IL12 Fc IL2 (#1100) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.1.6 Generation of the plasmid pMT/BiP SCA431scFv Fc
(#1103) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.1.7 Generation of the plasmid pMT/BiP SCA431scFv Fc
IL7 (#1117) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.1.8 Generation of the plasmid pMT/BiP SCA431scFv Fc
IL15 (#1118) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.1.9 Evaluation of transfection efficiency in insect cells . . 70
4.1.10 Insect cells are stably transfected to express immuno
cytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.2 Purified immunocytokines specifically bind to CD30 . . . . . 75
4.2.1 Detection of the individual domains of purified im
munocytokines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.2.2 Immunocytokines specifically bind to the anti
idiotypic antibody 9G10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.2.3 CD30 competes with the anti idiotypic antibody 9G10
in binding to immunocytokines . . . . . . . . . . . . . 80
+4.2.4 Immunocytokines specifically bind to CD30 tumour
cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
viiContents
4.3 Purified immunocytokines exhibit cytokine activity . . . . . . 82
4.3.1 Immunocytokines induce proliferation and IFN-? se
cretion in PBMCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
4.3.2 The IL 12 domain of immunocytokines induces phos
phorylation of STAT4 in T cells . . . . . . . . . . . . . . 90
4.3.3 Immunocytokines induce NK cells to lyse tumour cells 92
4.4 Immunocytokines accumulate at the tumour site . . . . . . . 96
4.4.1 I retain specificity of binding after
radiolabelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.4.2 Immunocytokines accumulate a

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