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Application of Models for Biomolecular Structure and Interactions to Understand and Influence Biological Function [Elektronische Ressource] / Irene Meliciani. Betreuer: S. Bräse

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139 pages
Application of Models for Biomolecular Structure and Interactions to Understand and Influence Biological Function Zur Erlangung des akademischen Grades eines DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (Dr. rer. nat.) Fakultät für Chemie und Biowissenschaften Karlsruher Institut für Technologie (KIT) - Universitätsbereich genehmigte DISSERTATION von Irene Meliciani aus Rom (Italien) Dekan: Prof. Dr. Martin Bastmeyer Referent: Prof. Dr. Stefan Bräse Korreferent: Apl. Prof. Dr. Wolfgang Wenzel Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2011 a mamma e papà Application of Models for Biomolecular Structure and Interactions to Understand and Influence Biological Function Irene Meliciani Karlsruher Institut für Technologie Institut für Nanotechnologie Intitut für Organische Chemie Zusammenfassung Die Forschung in den Lebenswissenschaften hat in den letzten Jahrzehnten zu einem enormen Wissensgewinns bezüglich der Abläufe zellulärer Prozesse und ihrer Steuerung geführt. Die Steuerung biologischer Prozesse wird vielfach über Kontaktwechselwirkungen der daran beteiligten Biomoleküle bewältigt. Mit dieser Arbeit möchte ich zu einem besseren Verständnis biomolekularer Interaktionen beitragen.
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Application of Models for Biomolecular Structure and
Interactions to Understand and Influence Biological Function


Zur Erlangung des akademischen Grades eines
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
(Dr. rer. nat.)
Fakultät für Chemie und Biowissenschaften
Karlsruher Institut für Technologie (KIT) - Universitätsbereich
genehmigte

DISSERTATION
von
Irene Meliciani
aus
Rom (Italien)





















Dekan: Prof. Dr. Martin Bastmeyer
Referent: Prof. Dr. Stefan Bräse
Korreferent: Apl. Prof. Dr. Wolfgang Wenzel
Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2011 a mamma e papà





Application of Models for Biomolecular Structure and Interactions
to Understand and Influence Biological Function















Irene Meliciani

Karlsruher Institut für Technologie
Institut für Nanotechnologie
Intitut für Organische Chemie




Zusammenfassung

Die Forschung in den Lebenswissenschaften hat in den letzten Jahrzehnten zu einem
enormen Wissensgewinns bezüglich der Abläufe zellulärer Prozesse und ihrer Steuerung
geführt. Die Steuerung biologischer Prozesse wird vielfach über Kontaktwechselwirkungen
der daran beteiligten Biomoleküle bewältigt. Mit dieser Arbeit möchte ich zu einem besseren
Verständnis biomolekularer Interaktionen beitragen.
Ein Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von Proteininteraktionen,
wobei als Methoden für die Modellierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (POEM)
und für die Protein-Liganden-Wechselwirkung (FLEXSCREEN) eingesetzt wurden. Es
wurden die Interaktionen der Chemokinrezeptoren CCR3 und CXCR1 mit für den
Entzündungsverlauf wichtigen Steuerungsmolekülen (Chemokinen) untersucht. Dazu wurde
ein in silico Alanin-Scanning-Protokoll entwickelt, welches experimentelle Verfahren zur
Untersuchung wichtiger Interaktionen in der Protein-Protein-Kontaktfläche ergänzt. Die
Untersuchungen zielen auf die Entwicklung neuer Inhibitoren für Chemokinrezeptoren ab, um
inflammatorische Krankheiten besser behandeln zu können.
In einer weiteren Untersuchung wurde versucht, neue Wirkstoffmoleküle für die
Cannabinoidrezeptoren CB1 und CB2 zu entwickeln, die in den Huntington und Alzheimer
Krankheiten eine wichtige Rolle spielen. Dazu wurden Strukturmodelle für die
Proteinrezeptoren erstellt und das Bindungsverhalten von Cumarinderivaten untersucht. In
enger Zusammenarbeit mit dem Experiment wurde eine Reihe neuer Liganden synthetisiert
und experimentell validiert, wobei sich eine erhöhte Affinität verglichen mit dem
Referenzmolekül und eine gute, quantitative Übereinstimmung zwischen Simulation und
Experiment zeigte. In einer letzten Anwendung im Bereich der rechnergestützten
Medikamentenentwicklung wurde eine grosse Datenbank einem virtuellen Screening
unterzogen, um neune Substanzen zu finden die regulierend in die Blutgerinnung
einzugreifen.
Ein weiteres wichtiges Anwendungsfeld ist die Identifizierung genetischer Ursachen für
Entwicklungsstörungen, die von patientenspezifischen Mutationen herrühren. Darüber hinaus
habe ich Methoden der Protein-Strukturvorhersage angewandt, um die Relevanz von
Mutationen, die an Patienten, die an Kallmann-Syndrom (KS), sowie normosmic
hypogonadotropen hypogonadismus (nHH) leiden für den Krankheitsverlauf aufzuklären.
Diese Ergebnisse zeigen, dass rechnergestützte Verfahren zur Modellierung der Struktur von
Biomolekülen und deren Wechselwirkungen heute dazu beitragen können, die komplexen
zellulären Steuerungsmechanismen zu verstehen und gegebenenfalls auch zu beeinflussen.
Damit erwächst aus den rechnergestützten Verfahren ein neues wichtiges Instrument um
biologische Prozesse zu verstehen und die pharmazeutische Forschung voranzutreiben.








Table of contents

1. Overview ................................................................................................................. 7
2. Introduction ......................................................................................................... 13
2.1. Introduction ........................................................................................................ 13
2.2. Protein Structure ............................................................................................... 14
2.3. Protein Structure Prediction ............................................................................. 19
2.3.1. Comparative Modeling .......................................................................... 20
2.3.2. Model Building ....................................................................................... 21
2.3.3. Loop Modeling ....................................................................................... 23
2.3.4. Side Chain Modeling ............................................................................. 23
2.3.5. Quality Assessment .............................................................................. 24
2.3.6. State of the Art....................................................................................... 24
2.4. Protein Ligand Interactions............................................................................... 26
2.4.1. Docking Methods .................................................................................. 27
2.4.2. Estimates of the Affinity ........................................................................ 29
2.5. Protein Protein Interactions .............................................................................. 30
2.5.1. Protein Protein docking ........................................................................ 31
2.5.2. Alanine scanning mutagenesis ............................................................ 33
3. Application of protein structure prediction to identify genetic causes
for human disease .................................................................................................. 37
3.1. Introduction ........................................................................................................ 37
3.2. Methods.............................................................................................................. 39
3.3. Investigation of Mutations in CHD7 ................................................................. 40
3.3.1. Sequence Based Analysis of Mutations ............................................. 41
3.3.2. Structural Models of CHD7 Domains .................................................. 42
3.3.3. Conclusions ........................................................................................... 44
3.4. Investigation of mutations in WDR11 ............................................................. 45
3.4.1. Protein Modeling ................................................................................... 45
3.4.2. Analysis of Mutations ............................................................................ 46
3.4.3. Discussion.............................................................................................. 47



3.5. Investigation of mutations in Nasal Embryonic LHRH Factor (NELF) ......... 51
3.5.1. Protein Modeling ................................................................................... 52
3.5.2. Conclusions ........................................................................................... 53
3.5.3. Discussion ............................................................................................. 54
3.6. Summary ............................................................................................................ 55
4. Protein Protein Interactions ............................................................................. 59
4.1. Introduction ........................................................................................................ 59
4.2. Methods ............................................................................................................. 61
4.2.1. The forcefield PFF02 ............................................................................ 61
4.2.2. Simulation Protocol ............................................................................... 64
4.3. Elucidating specificity for interleukin-8 and its receptor CXCR1 .................. 65
4.4. Elucidating specificity for ERBIN and its receptor ERBB2 ............................ 67
4.5. Elucidating specificity for eotaxin and its receptor CCR3.............................. 69
4.6. Summary ............................................................................................................ 73
5. Protein Ligand Interactions .............................................................................. 77
5.1. Introduction ........................................................................................................ 77
5.2. Methods ............................................................................................................. 78
5.3. Small Molecule Ligands for Binding Chemokines .......................................... 80
5.4. Selective high-affinity inhibitors of cannabinoid receptors CB1/CB2 ........... 83
5.4.1. Model Building and Validation ............................................................. 83
5.4.2. Design of novel ligands ........................................................................ 86
5.4.3. Origins of CB1/CB2 selectivity ............................................................. 89
5.4.4. Conclusions ........................................................................................... 93
5.5. Modulating activation of antithrombin in presence of heparin ...................... 94
5.5.1. In-Silico Alanine Screen ....................................................................... 95
5.5.2. In-Silico Screening ................................................................................ 99
5.5.3. Conclusions ......................................................................................... 100
5.6. Summary .......................................................................................................... 101
6. Summary ............................................................................................................ 103
List of Figures ........................................................................................................ 109
List of Tables ......................................................................................................... 111
APPENDIX Compound Names ........................................................................... 113
References ............................................................................................................. 115
Acknowledgements .............................................................................................. 137

1. Overview
The completion of the human and the other genome projects has further accelerated the rapid
growth of the available biological data. Efficient methods now exist to characterize the
components of biological systems at the genetic, molecular, cellular and whole organism
level, for example, the enzymes and metabolites in a metabolic pathway (Jeong, Tombor et al.
2000; Snoep, Bruggeman et al. 2006). All of these developments bring us closer to the
tantalizing prospect to understand, control and ultimately design biological function. The
recent progress of the genome sequence projects and of other molecular biology projects has
increased the opportunities to seriously look into the possibility of system-level
understanding.
One new promising branch is systems biology which has the potential to generate many new
insights for biomedical research, industry and agriculture. Its primary goal is to understand
life processes. Systems biology explores the dynamic life of processes at all levels, from the
organization of cell organelles up to the complete cell, the genome via the proteome and to the
entire organism. Methods from different fields are combined to explore these processes.
Quantitative methods are now used in molecular biology incorporating knowledge from the
fields of mathematics, informatics, and chemistry and physics. Systems biology focuses on
the interplay of the molecular components that play an indispensable role forming symbiotic
state of the system as a whole. Many areas are actively investigated, such as robustness of
biological systems, network structures and dynamics, and applications to drug discovery
(Kitano 2002; Kitano 2002; Kitano 2003).
One of the most important aspects to understand and control biological processes is the
molecular level, where biological control is mediated by the interactions of specific
biomolecules. Examples of such interactions are gene regulation (heat shock response, Fig.
1.1), protein-protein interaction (chemokine receptors in inflammation, Fig. 1.2) and small
drug molecules (e.g. Cannabinoid receptor antagonists, Fig. 1.3). The heat-shock (HS)
response is a good illustration of gene regulation where the heat-shock (HS) network ensures
the survival of various organisms at different temperatures. Regulatory systems initiate a
response that increases the resistance of cells to damage and aids in its repair, because they
have evolved to detect the damage associated with stressors. HS response (Gross 1996) is one
of the most important example of these systems. The HS response comprises elaborate
mechanisms for detecting the presence of heat or other stressor-related protein damage (Ang,
7
Application of Models for Biomolecular Structure and Interactions to Understand and Influence Biological Function
Liberek et al. 1991) and for initiating a response through the synthesis of new heat-shock
proteins (HSPs) whose main function is to refold denatured cellular proteins.

32
Figure 1.1: example of the recognition of an Escherichia coli heat shock gene by the σ subunit (Brown
2002). (A) The sequence of the heat-shock promoter is different from that of the normal E. coli promoter.
70
(B) The heat-shock promoter is not recognized by the normal E. coli RNA polymerase containing the σ
32subunit, but is recognized by the σ RNA polymerase that is active during heat shock.
In this thesis I have focused the theoretical investigation of biomolecular interactions with
applications in drug discovery and the modulation of protein-protein interactions. Because
such studies rely on the existence of a model for the protein receptor, I have also applied
methods of protein structure prediction. Identification, quantification, and control over
biological complexes are a key to research in drug-discovery, cell signaling, and elucidation
of biosynthetic pathways and understanding of enzyme catalysis. Many of the projects
discussed below combine experimental and computational approaches to better understand the
nature of biomolecular interactions.
Protein-protein interactions are important in many biological networks, e.g. chemokine
receptors play an important role in inflammation. One example is the leukocyte activation in
8