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Approaches to overcome the blood-brain barrier in the chemotherapy of primary and secondary brain tumors [Elektronische Ressource] : modulation of P-glycoprotein 170 and targeting of the transferrin receptor / vorgelegt von Martina Hubensack

250 pages
Approaches to Overcome the Blood-Brain Barrier inthe Chemotherapy of Primary and SecondaryBrain Tumors:Modulation of P-glycoprotein 170 andTargeting of the Transferrin ReceptorDissertationzur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer.nat.)der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie -der Universität Regensburgvorgelegt vonMartina Hubensackaus Ingolstadt2005Für RalphDie vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von August 2001 bis Januar 2005 unter derLeitung von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer am Institut für Pharmazie der Naturwis-senschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie - der Universität Regensburg.Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im Januar 2005.Tag der mündlichen Prüfung: 15. Februar 2005Prüfungsausschuß: Prof. Dr. J. Heilmann (Vorsitzender)Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter)Prof. Dr. A. Göpferich (Zweitgutachter)Prof. Dr. A. Kurtz (Prüfer)An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei:HerrnProf.Dr.A.BuschauerfürdieinteressanteAufgabenstellung, diewissenschaftlichenAnregungen und Förderung, sowie für die konstruktive Kritik bei der Durchsicht derArbeit.HerrnPDDr.G.BernhardtfürdieumfassendeBetreuung, diewissenschaftlicheAnleitungsowie für zahlreiche konstruktive Diskussionen während der Laborzeit und der Durchsichtder Arbeit.Herrn Dr. T. Spruß für die Unterstützung bei der Durchführung der Tierversuche undder histologischen Untersuchungen.Herrn Prof. Dr. A. Kurtz und Herrn Dr. H.
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Approaches to Overcome the Blood-Brain Barrier in
the Chemotherapy of Primary and Secondary
Brain Tumors:
Modulation of P-glycoprotein 170 and
Targeting of the Transferrin Receptor
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer.nat.)
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie -
der Universität Regensburg
vorgelegt von
Martina Hubensack
aus Ingolstadt
2005Für RalphDie vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von August 2001 bis Januar 2005 unter der
Leitung von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer am Institut für Pharmazie der Naturwis-
senschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie - der Universität Regensburg.
Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im Januar 2005.
Tag der mündlichen Prüfung: 15. Februar 2005
Prüfungsausschuß: Prof. Dr. J. Heilmann (Vorsitzender)
Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter)
Prof. Dr. A. Göpferich (Zweitgutachter)
Prof. Dr. A. Kurtz (Prüfer)An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei:
HerrnProf.Dr.A.BuschauerfürdieinteressanteAufgabenstellung, diewissenschaftlichen
Anregungen und Förderung, sowie für die konstruktive Kritik bei der Durchsicht der
Arbeit.
HerrnPDDr.G.BernhardtfürdieumfassendeBetreuung, diewissenschaftlicheAnleitung
sowie für zahlreiche konstruktive Diskussionen während der Laborzeit und der Durchsicht
der Arbeit.
Herrn Dr. T. Spruß für die Unterstützung bei der Durchführung der Tierversuche und
der histologischen Untersuchungen.
Herrn Prof. Dr. A. Kurtz und Herrn Dr. H. Castrop für die Unterstützung beim Erlernen
und der Durchführung der RT-PCR Untersuchungen.
Herrn M. Henry von der Firma GlaxoSmithKline sowie Herrn R. Robey vom NIH für die
Bereitstellung der Inhibitoren.
Herrn F. Wiesenmayer und Herrn O. Baumann für die Unterstützung bei der Durch-
führung der Tierversuche.
Frau P. Pistor und Frau K. Frank für die Erstellung und Färbung der histologischen
Schnittserien sowie für die Unterstützung bei der Durchführung der immunhistologischen
Färbungen.
Frau S. Bollwein und Frau C. Müller für die Hilfe bei der Homogenisierung der Gewe-
beproben.
Herrn J. Zimmermann für die Unterstützung und den Platz bei der Durchführung der
chemischen Synthesen.
Frau S. Bollwein und Herrn M. Keller für die fachliche Unterstützung und die gute Zusam-
menarbeit im Labor.
Frau S. Heinrich und Herrn P. Richthammer für die Hilfsbereitschaft und Unterstützung
bei vielen organisatorischen und technischen Dingen.
allen Mitgliedern des Lehrstuhls für ihre Kollegialität und Hilfsbereitschaft.der Schafkopfgruppe (Sigrid, Christian und Erich) für die vielen lustigen und aufheitern-
den Stunden abseits des Laboralltags.
meinen Kollegen Christine, Edith, Manuela, Sunnhild, Alex, Christian, Erich, Georg,
Hendrik, Jochen, Ralf und Stephan für die Unterstützung bei fachlichen Problemen und
die vielseitigen Erlebnisse im Laufe der gemeinsamen Zeit.
meiner Schwägerin Claudia für ihre geduldige und unermüdliche Lesebereitschaft.
meiner Famile, vor allem meinen Eltern sowie Herta und Willy für all ihre Unterstützung.
meinem Mann Ralph für Toleranz, Geduld und seine offenen Ohren in den letzten drei
Jahren.Contents I
Contents
1 Introduction 1
1.1 Barriers inhibiting drug delivery to the brain . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 The Blood-Brain Barrier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.2 The Blood-CSF Barrier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1.3 The Blood-Tumor-Barrier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 Drug delivery into the brain: different approaches to overcome the BBB . . 6
1.2.1 Improvement of the physicochemical properties . . . . . . . . . . . 6
1.2.2 Prodrugs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.3 Chemical drug delivery systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.4 Carrier- and receptor mediated transport . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.5 Disruption of the BBB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.6 Modulation of efflux transporters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.2.7 Liposomes and nanoparticles as carrier systems . . . . . . . . . . . 16
1.2.8 Direct intracerebral delivery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.9 Brain drug uptake using the olfactory pathway . . . . . . . . . . . . 18
1.2.10 Alternative routes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.2.11 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3 ABC transporters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.3.1 ABCB1 - P-glycoprotein 170 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.3.2 ABCC1 - MRP1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.3.3 ABCG2 - BCRP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2 Objectives 35II Contents
3 Characterization of human lung cancer cell lines 37
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.2 Materials and methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.2.1 Drugs and chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.2.2 Culture conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.2.3 Cytological and histological staining . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.2.4 In vitro growth determination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.2.5 Metaphase chromosomes preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.2.6 Chemosensitivity assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.2.7 In vivo experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.3 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.3.1 Origin and morphology of selected lung cancer cell lines . . . . . . . 44
3.3.2 In vitro growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.3.3 Chromosome distribution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.3.4 Chemosensitivity against selected cytostatic drugs . . . . . . . . . . 53
3.3.5 In vivo growth characteristics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.4 Summary and conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4 Establishment and application of a calcein-AM efflux assay 71
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.2 Materials and methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.1 Drugs and reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.2 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.3 Calcein-AM efflux assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.2.4 Time-resolved measurements on the flow cytometer . . . . . . . . . 76
4.3 Principle of the calcein-AM efflux assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.4 Optimization of the calcein-AM efflux assay for flow cytometry . . . . . . . 78
4.5 Applications of the efflux assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.5.1 Identification of p-glycoprotein expressing cells . . . . . . . . . . . . 82
4.5.2 Characterization of substrates and modulators . . . 83
4.5.3 Investigationoftransport mechanismsbytime-resolvedmeasurements 87