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Cell adhesion and cell mechanics during zebrafish development [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Michael Krieg

De
237 pages
Cell adhesion and cell mechanicsduring zebra sh developmentDISSERTATIONvorgelegt von Dipl. Biol. Michael Krieg am 02.10.2009zur Erlangung des akademischen Grades Dr. rer. nat.der Fakult at fur Naturwissenschaftender Technischen Universit at DresdenTag der mundlic hen Verteidigung: 07.12.2009Consultant 1 Consultant 2Prof. Dr. Daniel J. Muller Prof. Dr. Carl-Philipp HeisenbergBiotec / TU-Dresden MPI-CBG DresdenConsultant 1 Consultant 2Prof. Dr. Daniel J. Muller Prof. Dr. Carl-Philipp HeisenbergDepartment of Cellular Machines MPI-CBG DresdenBiotec / TU-Dresden... to my family ...... my parents and my sisters ...Wenn ich ein Problemosenl will, dann darf durch die L osungkein Bestandteil des Problems verschwinden Albert Camus.ContentsPreface 11 Motivation and Summary 32 Introduction 92.1 Zebra sh gastrulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.1.1 Time course of development . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.1.2 Nodal signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142.1.3 Germ layer formation and epithelial mesenchymal transition 152.2 Adhesion and mechanics in development . . . . . . . . . . . . . . 192.2.1 Mechanical forces during tissue formation . . . . . . . . . . 202.2.2 Shaping cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.3 Cell adhesion molecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342.3.1 Integrins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352.3.2 Cadherins . . . . .
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Cell adhesion and cell mechanics
during zebra sh development
DISSERTATION
vorgelegt von Dipl. Biol. Michael Krieg am 02.10.2009
zur Erlangung des akademischen Grades Dr. rer. nat.
der Fakult at fur Naturwissenschaften
der Technischen Universit at Dresden
Tag der mundlic hen Verteidigung: 07.12.2009
Consultant 1 Consultant 2
Prof. Dr. Daniel J. Muller Prof. Dr. Carl-Philipp Heisenberg
Biotec / TU-Dresden MPI-CBG DresdenConsultant 1 Consultant 2
Prof. Dr. Daniel J. Muller Prof. Dr. Carl-Philipp Heisenberg
Department of Cellular Machines MPI-CBG Dresden
Biotec / TU-Dresden... to my family ...
... my parents and my sisters ...Wenn ich ein Problemosenl will, dann darf durch die L osung
kein Bestandteil des Problems verschwinden Albert Camus.Contents
Preface 1
1 Motivation and Summary 3
2 Introduction 9
2.1 Zebra sh gastrulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.1.1 Time course of development . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.1.2 Nodal signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.1.3 Germ layer formation and epithelial mesenchymal transition 15
2.2 Adhesion and mechanics in development . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.1 Mechanical forces during tissue formation . . . . . . . . . . 20
2.2.2 Shaping cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.3 Cell adhesion molecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.1 Integrins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.3.2 Cadherins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.4 Cell adhesion techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4.1 Image-based techniques to characterize cell adhesion . . . . 43
2.4.2 Techniques to measure cell adhesion forces . . . . . . . . . 46
2.5 AFM { an all-in-one toolbox for cell mechanics . . . . . . . . . . . 51
2.5.1 Single cell adhesion force spectroscopy . . . . . . . . . . . 51
2.5.2 Single cell elastography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3 Experimental Section 63
3.1 Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.1.1 AFM and SCFS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.1.2 Cell elasticity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.1.3 Fluorescence recovery after photobleaching . . . . . . . . . 70
3.2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.2.1 mRNA preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 713.2.2 Single cell microinjection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2.3 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.2.4 Hanging drop experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.2.5 In-vitro biotinylation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.2.6 Western blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.2.7 The AFM setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.2.8 Adhesion measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.2.9 Cell-cortex tension measurements . . . . . . . . . . . . . . 81
3.2.10 Tether extraction using AFM . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.2.11 FRAP Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.2.12 Non-covalent surface modi cations . . . . . . . . . . . . . 86
3.2.13 Covalent surface modi cation . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.2.14 Statistical data processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.2.15 Single cell transplantations . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.2.16 Laser scanning confocal microscopy . . . . . . . . . . . . . 89
3.2.17 Image processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.3 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.3.1 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.3.2 Western blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
3.3.3 Atomic force microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
4 Cell sorting and surface mechanics 95
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.2 Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2.1 Adhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2.2 Cortex Tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
4.2.3 Cell sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
5 Cell cohesion and migration 119
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
5.2 Results and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
5.2.1 Collective cell migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
5.2.2 Migration in crowded and abandoned environment . . . . . 122
5.2.3 Modulation of cell adhesion properties . . . . . . . . . . . 123
5.2.4 Cell migration and cell-cell adhesion . . . . . . . . . . . . . 125
5.2.5 Summary of adhesion force measurements . . . . . . . . . 130