Cellular response to double-stranded RNA in Chlamydia trachomatis infected human host cells [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Linda Böhme

L.Böhme

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: julius-maximilians-universitat_wurzburg
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 25
• Poids de l'ouvrage: 11 Mo

Extrait

 
 
Cellular response to double‐stranded RNA in  
Chlamydia trachomatis‐infected human host cells 
 
 
 
 
DDISSERTATIOON  
zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades 
doctor rerum naturalium 
(Dr. rer. nat.) 
imm Fach Biologie 
 
 
vvorgelegt voon 
Dipl.‐Biol. Linda Böhme 
aus Berlin
 
an der Bayerischen Julius‐Maximilians‐Universität Würzburg 
 
 
Würzburg, Dezember 2009 
  
 
 
 
 
 
 
 




 
 
 
 
 
 
 
Eingereicht am:  21.12.2009 
 
Mitglieder der Prüfungskommission: 
 
Vorsitzender: Prof. Dr. Thomas Dandekar 
Erstgutachter: Prof. Dr. Thomas Rudel 
Zweitgutachter: Prof. Dr. Thomas Hünig 
 
Tag des Promotionskolloquiums:  12.03.2010 
 
Doktorurkunde ausgehändigt am: 
 
 
 
 
  
 I. TABLE OF CONTENTS 
I. TABLE OF CONTENTS 
II. ABBREVIATIONS  1 
III. ZUSAMMENFASSUNG  3 
IV. ABSTRACT  4 
1. INTRODUCTION  6 
1.1 Chlamydia  6 
1.1.1 Taxonomy of Chlamydia  6 
1.1.2 Medical relevance of Chlamydia infections  7 
1.1.3 Developmental cycle of Chlamydia  8 
1.2 Programmed cell death  10 
1.2.1 Types of PCD  11 
1.2.2 Biochemical features of apoptosis  12 
1.2.3 Intrinsic pathway of apoptosis  14 
1.2.4 Extrinsic pathway of   15 
1.2.5 PCD and infection  18 
1.2.6 Chlamydia and apoptosis  19 
1.3 The cellular response to dsRNA  20 
1.3.1 Innate immunity signalling in response to dsRNA  21 
1.3.1.1 PKR  21 
1.3.1.2 RNase L  22 
1.3.1.3 TLR3  22 
1.3.1.4 RIG‐I and MDA5  23 
1.3.1.5 IRF‐3 and NF‐κB  24 
1.3.2 dsRNA‐induced apoptosis signalling  24 
1.4 Aim of this work  25 
2. MATERIALS AND METHODS  26 
2. 1 Materials  26 
2.1.1 Cell lines  26 
2.1.2 Bacterial strains  26 
2.1.3 Oligonucleotides  26 
2.1.4 Antibodies  27 
2.1.5 Chemicals  28 
2.1.6 Kits  28 
2.1.7 Buffers, solutions, and media  29 
2.1.8 Technical equipment  30 
 I. TABLE OF CONTENTS 
2.1.9 Software  30 
2.2 Methods  31 
2.2.1 Cell biological methods  31 
2.2.1.1 Cell cultivation  31 
2.2.1.2 Cryo stocking of cell lines  31 
2.2.1.3 Infection with C. trachomatis  31 
2.2.1.4 Infection with C. pneumoniae  32 
2.2.1.5 Preparation of Chlamydia stocks  32 
2.2.1.6 Titration of chlamydial stocks  32 
2.2.1.7 Infectivity assay  33 
2.2.1.8 Treatment with inhibitors or antibiotics  33 
2.2.1.9 siRNA transfection  34 
2.2.1.10 Application of polyI:C  34 
2.2.1.11 Apoptosis induction  34 
2.2.1.12 TUNEL assay  34 
2.2.1.13 Luminescent caspase‐8 activity assay  35 
2.2.1.14 Fluorescence‐activated cell sorting (FACS)  35 
2.2.1.15 Confocal microscopy  36 
2.2.1.16 Statistical analysis  36 
2.2.2 Biochemical methods  36 
2.2.2.1 SDS‐PAGE and immunoblotting  36 
2.2.2.2 Native PAGE  37 
2.2.2.3 Co‐Immunoprecipitation  38 
2.2.2.4 Subcellular fractionation  38 
2.2.2.5 Fluorescent labelling of polyI:C  39 
2.2.3 Molecular biological methods  39 
2.2.3.1 RNA‐Isolation  39 
2.2.3.2 DNA digestion  39 
2.2.3.3 Determination of RNA concentration  39 
2.2.3.4 Copy (c)DNA synthesis  40 
2.2.3.5 Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT‐PCR)  40 
2.2.3.6 Measurement of 28S rRNA  40 
3. RESULTS  41 
3.1 Influence of Chlamydia trachomatis infection on dsRNA‐induced apoptosis  41 
3.1.1 C. trachomatis infected host cells resist polyI:C‐induced apoptosis  41 
3.1.2 Apoptosis inhibition is MOI‐dependent and requires early bacterial protein synthesis  42 
3.1.3 DNA fragmentation is reduced in infected host cells  44 
3.1.4 Infection with C. trachomatis inhibits polyI:C‐induced activation of caspase‐8  45 
3.1.4.1 Truncation of Bid is reduced in infected cells  45 
3.1.4.2 polyI:C‐induced caspase‐8 activity is inhibited in an MOI‐dependent manner  46 
3.1.4.3 The chlamydial block of caspase‐8 activity is stimulus‐specific  46 
 I. TABLE OF CONTENTS 
3.1.4.4 polyI:C‐induced caspase‐8 activity and apoptosis are inhibited by C. pneumoniae 
infection  47 
3.1.5 Uptake of polyI:C is not prevented by infection  48 
3.1.6 Impact of chlamydial infection on cellular dsRNA sensors  49 
3.1.6.1 PKR signalling is not impaired in infected cells  49 
3.1.6.2 RNase L activity is not altered by Chlamydia  50 
3.1.6.3 polyI:C‐induced apoptosis is independent of surface TLR3  51 
3.1.7 cFlip is required for caspase‐8 inhibition  51 
3.1.8 cFlip knock down sensitizes infected cells to polyI:C‐induced apoptosis  53 
3.1.9 Regulation of cFlip by C. trachomatis‐infection  54 
3.1.9.1 cFlip levels are mildly altered by C. trachomatis‐infection  54 
3.1.9.2 Confocal microscopic analysis of cFlip during infection  55 
3.1.10 Interaction of caspase‐8 and cFlip in infected host cells  56 
3.1.10.1 Caspase‐8 localization is not altered in infected cells  57 
3.1.10.2 Subcellular fractionation  58 
3.1.10.3 Co‐IP in C. trachomatis infected cells after polyI:C treatment  58 
3.1.11 Role of Mcl‐1 for chlamydial inhibition of polyI:C‐induced apoptosis  59 
3.1.11.1 dsRNA‐induced downregulation of Mcl‐1 is inhibited in infected host cells  59 
3.1.11.2 Chlamydia‐infected cells resist dsRNA‐induced apoptosis in the absence of Mcl‐1  60 
3.1.12 ERK is not required for inhibition of polyI:C‐ apoptosis during chlamydial infection
  61 
3.2. Influence of C. trachomatis on the cellular immune response to dsRNA  63 
3.2.1 IκB‐α degradation is enhanced in host cells infected with C. trachomatis  63 
3.2.2 Nuclear translocation of p65 is altered in infected cells  64 
3.2.3 polyI:C‐induced IRF‐3 translocation i