Chaperone mechanism of the small heat shock protein Hsp26 [Elektronische Ressource] / Titus Marcellus Franzmann

Frt207

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
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• Langue: Deutsch
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Extrait

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Lehrstuhl für Biotechnologie
Chaperone mechanism of the small heat shock protein Hsp26
Titus Marcellus Franzmann


Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität München
zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.


Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Horst Kessler
Prüfer der Dissertation:
1. Univ.-Prof. Dr. Johannes Buchner
2. Univ.-Prof. Dr. Thomas Kiefhaber
3. Univ.-Prof. Dr. Matthias Rief



Die Dissertation wurde am 20.05.2008 bei der Technischen Universität München eingereicht
und durch die Fakultät für Chemie am 18.08.2008 angenommen.
 
























To those who I love  
1 Summary / Zusammenfassung  
Die biologisch aktive dreidimensionale Struktur von Proteinen ist sensibel auf 
Änderungen  der  Umgebungstemperatur.  Unter  Hitzeschock  können  viele 
Proteine  ihre  natürliche  Struktur  verlieren  und  werden  in  eine  für 
Proteinaggregation  anfällige  Konformation  überführt.  Eine  Erhöhung  der 
Außentemperatur stellt demnach eine Bedrohung für alle Lebewesen dar. Um 
der  Proteinaggregation  in  der  Zelle  entgegenzuwirken,  nehmen  Zellen 
Temperaturunterschiede autonom wahr und antworten auf Hitzestress mit der 
Expression von Hitzeschockgenen. Die Produkte dieser Hitzeschockanwort sind 
die  Hitzeschockproteine  (Hsps),  von  denen  viele  als  molekulare  Chaperone 
identifiziert  wurden.  Molekulare  Chaperone  erkennen  nicht‐native 
Proteinstrukturen, binden diese spezifisch und verhindern durch Ausbildung 
eines  Chaperon‐Substrate‐Komplexes  Proteinaggregation.  Viele  Chaperone 
binden  und  hydrolysieren  ATP.  Die  freiwerdende  Energie  wird  oft  dazu 
verwendet, das Chaperon von einem hochaffinen in einen niederaffinen Zustand 
für  das  Substrate  zu  überführen  und  somit  die  Substratefreisetzung  zu 
ermöglichen. 
Kleine  Hitzeschockproteine  (engl.  small  heat  shock  proteins,  sHsps)  sind 
molekular Chaperone. sHsps binden entfaltete Proteine, bilden mit diesen stabile 
Substratkomplexe und verhindern so deren Aggregation. Im Gegensatz zu den 
ATP‐abhängigen Chaperonklassen binden und hydrolysieren sHsps kein ATP. 
Ihre  Aktivität  wird  durch  andere  Strategien,  wie  z.B.  durch  Hitze,  oder Veränderungen  des  zellulären  Redoxpotentials  reguliert.  Ein  Vertreter  der 
temperaturkontrollierten sHsps ist Hsp26 aus der Bäckerhefe. 
Hsp26  ist  das  generelle  kleine  Hitzeschockprotein  in  der  Bäckerhefe, 
Saccharomyces  cerevisiae.  Strukturuntersuchungen  haben  gezeigt,  dass  Hsp26 
Homooligomere  aus  24  Untereinheiten  bildet,  die  sich  zu  einer  ca.  600 kDa 
Hohlkugel zusammenlagern. Sequenzvergleiche zwischen sHsps haben gezeigt, 
dass sich die Hsp26 Domänenstruktur aus einer N‐terminalen Domäne, einer 
einzigartigen  Mitteldomäne,  der  strukturell  konservierten  α‐Kristallindomäne 
und einer C‐terminalen Extinsion zusammensetzt. Biochemische Analysen haben 
gezeigt, dass die N‐terminale Region von sHsps generell eine wichtige Funktion 
für  die  Substraterkennung  darstellt.  Dies  konnte  ebenfalls  für  Hsp26  gezeigt 
werden.  Eine  Hsp26  Variante,  der  die  ersten  30  Aminosäuren  fehlen,  wies 
reduzierte  Chaperonaktivität  auf  und  eine  Variante,  der  die  ersten  95  Reste 
fehlten  war  chaperoninaktiv.  Während  die  α‐Kristallindomäne  sowie  die  C‐
terminale Extension verantwortlich für die Oligomerisierung von Hsp26 sind, 
war die Funktion der Mitteldomäne bislang unbekannt. 
Eine  Besonderheit  von  Hsp26  ist,  dass  es  autonom  Temperaturänderungen 
wahrnehmen  kann  und  seine  Chaperonaktivität  temperaturabhängig  ist.  Erst 
unter Hitzeschockbedingungen, z.B. 45°C, ist Hsp26 in der Lage die Aggregation 
von  Substraten  zu  verhindern,  während  es  bei  25°C  die  Substrataggregation 
nicht  unterdrückt.  Mechanistische  Untersuchungen  haben  gezeigt,  dass  die 
Temperaturaktivierung  der  Hsp26‐Chaperonfunktion  gleichzeitig  die 
Oligomerstabilität herabsetzt. In analytischen Gelfiltrationsexperimenten konnte 
gezeigt werden, dass die temperatur‐induzierte Destabilisierung der Oligomere 
zur Dissoziation in Dimere führt. Gleichzeitig haben elektronenmikroskopische 
Untersuchungen  gezeigt,  dass  Hsp26‐Substratkomplexe  grundsätzlich  eine 
andere  Struktur  aufwiesen  als  Hsp26  in  Abwesenheit  von  Substraten.  Diese Beobachtungen haben zu einem mechanistischen Model geführt, in dem das 
Hsp26 Oligomer eine Speichergruppe darstellt, die unter Hitzeschock in aktive 
Dimere  dissoziert.  Diese  Dimere  binden  entfaltete  Substrate  Moleküle  und 
reassozieren zu Hsp26‐Substrate‐Komplexen. Die mechanistischen Details dieses 
Regulationsprinzips blieben jedoch bislang ungeklärt. 
Um weitere Details über den Hsp26 Chaperonmechanismus zu erlangen, wurden 
der  Hsp26 Temperaturaktivierungsmechanismus  und  die  damit  verbundenen 
temperatur‐induzierten  Strukturänderungen  thermodynamisch  und  kinetisch 
untersucht. Dazu wurden Hsp26 Varianten hergestellt, die sich spektroskopisch 
vom  Wildtyp  (wt)  Protein  unterschieden.  Zum  einen  wurden  Hsp26 
Cysteinvarianten hergestellt, in denen jeweils ein Serinrest in der N‐terminalen 
Domäne  (Hsp26S4C),  Mitteldomäne  (Hsp26S82C)  sowie  in  der  C‐ 
Extinsion  (Hsp26S210C)  durch  Cystein  ersetzt  wurde.  Desweiteren  wurden 
Tryptophanvarianten hergestellt, bei denen das Tryptophan der Mitteldomäne 
(W72)  und  das  der  C‐terminalen  Extension  (W211)  durch  Tyrosin  ersetzt 
wurden. 
Redoxanalysen haben gezeigt, dass Hsp26S4C und Hsp26S210C, jedoch nicht wt 
Hsp26 und Hsp26S82C, Disulfidbrücken bilden können. Die Ausbildung von 
Disulfidbrücken zwischen den N‐terminalen Domänen, sowie den C‐terminalen 
Extensionen innerhalb eines Oligomers hatte weder Einfluss auf die Sekundär‐ 
oder Tertiärstruktur noch auf die thermodynamische Stabilität. Jedoch wurden 
die  Oligomere  durch  die  Ausbildung  von  Disulfidbrücken  zwischen 
Untereinheiten in