Construction and molecular analysis of genetically modified C_1tn3 plants expressing a glycolate oxidizing pathway inside the chloroplast [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Rashad Mohamed Ahmed Kebeish

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• Publié le: 01 janvier 2006
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Extrait

"Construction and molecular analysis of genetically
modified C plants expressing a glycolate oxidizing 3
pathway inside the chloroplast"




Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-
Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation





vorgelegt von

Diplom-Biologe

Rashad Mohamed Ahmed Kebeish
aus Sharkia, Ägypten






Berichter: Universitätsprofessor Dr. F. M. Kreuzaler
Privatdozent Dr. C. Peterhänsel









Tag der mündlichen Prüfung: 10-04-2006


Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar





Institute for Biology I (Botany and Molecular Genetics)
RHEINISCH WESTFÄLISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE AACHEN






PhD Thesis

"Construction and molecular analysis of genetically
modified C plants expressing a glycolate oxidizing 3
pathway inside the chloroplast"







Presented by

Dipl.Biol. Rashad Mohamed Ahmed Kebeish
From Sharkia, Egypt








Scientific supervision
Referent: University Professor Dr. F. M. Kreuzaler
Co-referent: Privatdozent Dr. C. Peterhänsel

Aachen, April 2006



ZUSAMMENFASSUNG -I-

ZUSAMMENFASSUNG
Die Umsetzung von Glykolat in den Reaktionen der Photorespiration von C -Pflanzen 3
verbraucht nicht nur ATP und Reduktionsäquivalente, sondern führt auch zu einem Verlust
von 25% des in diesem Metabolit fixierten Kohlenstoffs. In der vorliegenden Arbeit wurde
ein neuer biochemischer Reaktionsweg für die Umsetzung von Glykolat in Arabidopsis
thaliana etabliert. Dieser neue Weg soll die CO -Konzentration in der Nähe von Rubisco 2
erhöhen und dadurch die Photorespiration in C -Pflanzen unterdrücken. Der Reaktionsweg 3
entstammt E. coli und wandelt das während der Photorespiration entstehende Glykolat in
Glycerat um. Die Aktivität von drei Enzymen wird dazu benötigt: Glykolat-Dehydrogenase
(GDH), Glyoxylat-Carboligase (GCL) und Tartronat-Semialdehyd-Reduktase (TSR). Die
Glykolat-Dehydrogenase aus E. coli besteht aus mindestens drei Polypeptiden. Als
Alternative wurde daher eine Glykolat-Dehydrogenase (AtGDH) aus A. thaliana genutzt.
Transgene A. thaliana Pflanzen mit den drei für diesen Reaktionsweg notwendigen Genen
wurden hergestellt. Variierende Mengen der transgenen Proteine sowie RNAs wurden durch
Western Blot und RT-PCR gemessen. Die enzymatische Aktivität der Proteine in planta
konnte nachgewiesen werden.
Biochemische, physiologische und biophysikalische Analysen wurden unter normalen und
photorespiratorischen Wachstumsbedingungen mit verschiedenen transgenen Linien
durchgeführt, um die Bedeutung des Stoffwechselweges in planta zu untersuchen. Durch die
Messung des Glycin/Serin-Verhältnis konnte eine deutliche Reduktion der Photorespiration
in transgenen Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp belegt werden. Ebenso deutlich war die
Reduktion der Menge an CO , die in den Mitochondrien der Pflanzen während der 2
Photorespiration entstand. Die Messung des freigesetzten NH in einem Bioassay stellte 3
einen zusätzlichen Beweis für die partielle Unterdrückung der Photorespiration in einigen
transgenen Linien dar. Desweiteren führte die Etablierung des Glykolat-Reaktionswegs in
*den Chloroplasten zu einer Reduktion des CO-Kompensationspunkts ( Γ). Die 2
Assimilationsrate von CO in den transgenen Linien war unter photorespiratorischen 2
Bedingungen erhöht. Durch die Messung des Wachstums von transgenen Pflanzen, die den
Glykolat-Reaktionsweg im Chloroplasten exprimieren, im Vergleich zum Wildtyp konnte
eine größere Blattfläche und ein größerer Durchmesser der Rosette nachgewiesen werden.
Interessanterweise wurden die meisten der beschriebenen Effekte auch in Pflanzen
beobachtet, die nur eine funktionsfähige GDH überexprimierten. Allerdings waren die


ZUSAMMENFASSUNG -II-

Effekte in Pflanzen, die alle notwendigen Elemente des Glykolat-Reaktionswegs
überexprimierten, stärker. Zudem waren die phänotypischen Effekte bei Nutzung der
bakteriellen GDH im Vergleich zu dem pflanzlichen Enzym deutlich ausgeprägter.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der neue Reaktionsweg in den
Chloroplasten von C -Pflanzen nicht nur zu einer Reduktion der Photorespiration, sondern 3
auch zu einem erhöhten Pflanzenwachstum führt.
























SUMMARY -I-

SUMMARY

Metabolism of glycolate via the photorespiratory pathway in C plants consumes not only 3
ATP and reducing equivalents but results also in approximately 25% loss of the carbon from
glycolate. In the present study, a novel biochemical pathway for the metabolism of glycolate
was established in the chloroplast of Arabidopsis thaliana plants. The new pathway aims to
increase the CO concentration in the vicinity of Rubisco thereby suppressing 2
photorespiration in C plants. The pathway is derived from E. coli and converts the glycolate 3
formed during photorespiration into glycerate. Three enzymatic activities are required:
glycolate dehydrogenase (GDH), glyoxylate carboligase (GCL), and tartronic semialdehyde
reductase (TSR). The minimal E.coli glycolate dehydrogenase enzyme is formed from three
different polypeptides. As an alternative, a glycolate dehydrogenase (AtGDH) derived from
A. thaliana was used. Transgenic A. thaliana plants containing the necessary genes for the
novel pathway were generated. Variable amounts of foreign proteins as well as RNA were
detected by Western blot and RT-PCR, respectively. Enzymatic assays showed that the
proteins are active in planta.
Biochemical, physiological and biophysical analyses were performed under ambient and
enhanced photorespiratory conditions using different transgenic lines for evaluating the
impact of the novel pathway in planta. By measuring the Gly/Ser ratio, a clear reduction in
photorespiration was observed in transgenic plants expressing the novel pathway genes
compared to wild type plants. A clear decrease in the amount of CO released in the plant 2
mitochondria during photorespiration was also obvious in transgenic lines. The ammonia
release bioassay provides an additional evidence for the partial suppression of
photorespiration in some of the transgenic lines. Furthermore, establishment of the glycolate
pathway in the plant chloroplasts results in a decrease in the CO compensation point ( Г ). 2 *
The CO assimilation rates in transgenic plants were also enhanced under photorespiratory 2
conditions. Finally, plant growth measurements revealed that the transgenic plants expressing
the glycolate pathway in their chloroplasts have bigger leaf area as well as bigger rosette
diameter compared to the control plants. Moreover, the total fresh and dry weight
measurements showed that the total plant productivity was enhanced. Interestingly, most of
the described effects were also observed in plants that only overexpressed a functional GDH.
However, these effects were stronger in plants overexpressing all necessary elements of the


SUMMARY -II-

glycolate pathway. Moreover, the phenotypical effects were much stronger when the
bacterial GDH was compared to the plant GDH. Taken together, it can be concluded that
expression of the novel pathway in C plant chloroplast does not only result in a reduction of 3
photorespiration but it also enhances plant growth.



TABLE OF CONTENTS -III-
TABLE OF CONTENTS
1 Introduction..................................................................................................................1
1.1 Photosynthesis..............................................................................................................1
1.1.1 C -photosynthesis......................................................................................................... 3 3
1.1.2 C -photosynthesis........................................................................................................ 4 4
1.1.3 The