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Contribution à l'élucidation de la fonction de la protéine STAC2 dans la spécification des neurones somatiques sensoriels, Contribution to elucidate the function of STAC2 protein in the specification of somatic sensory neurons

De
168 pages
Sous la direction de Aziz Moqrich, Serge Alonso
Thèse soutenue le 03 mai 2010: Aix Marseille 2
Le système nerveux sensoriel somatique détecte et transmet les informations sensorielles périphériques par les neurones sensoriels dont le corps cellulaire est englobé dans les ganglions de la racine dorsale et les ganglions trijumeaux. Bien que cette hétérogénéité fonctionnelle a été mise en évidence, les mécanismes moléculaires qui la caractérisent sont moins connus. Dans l’optique de contribuer à la caractérisation moléculaire de la population neuronale du DRG, nous avons identifié un nouveau gène, stac2. Nous avons pu montrer que stac2 spécifie une sous population neuronale distincte dans le DRG. L’invalidation génétique de stac2 chez la souris n’a révélé aucun effet sur la survie ni sur la maturation neuronale. L’analyse comportementale des souris dépourvues de stac2 a montré un rôle important de stac2 dans la perception et la discrimination des températures fraîches ainsi que dans la sensibilisation périphérique au froid nocif.
-Système nerveux somatique sensoriel
-Hétérogénéité
-Drg
-Stac2
The somatic sensory nervous system detects and transmits sensory information from peripheral by sensory neurons that have their cell body encompassed in the dorsal root and trigeminal ganglia. Although this functional heterogeneity has been demonstrated, the molecular mechanisms characterizing it are less known. In order to contribute to the molecular characterization of the neuronal population of DRG, we have identified a new gene, stac2. We have shown that stac2 specifies a distinct neuronal subpopulation in the DRG. The genetic invalidation of stac2 in mice showed no effect of stac2 on neuronal survival and maturation. The behavioral analysis of mice lacking stac2 showed an important role of this gene in the perception and discrimination of cold temperatures and in the peripheral sensitization to noxious cold.
-Somatic Sensory Nervous system
-Heterogeneity
-Drg
-Stac2
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22031/document
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UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
Aix- Marseille II
Faculté des Sciences de Luminy




THESE

Pour obtenir le garde de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE LA MÉDITÉRRANÉE
Discipline : Neurosciences
Présentée et soutenue publiquement
Par
Wassim LEGHA
Le 03 Mai 2010


Contribution à l’élucidation de la fonction de la protéine STAC2
dans la spécification des neurones somatiques sensoriels

Directeur de thèse : Aziz MOQRICH



JURY

Keith DUDLEY (INMED - Marseille) Président
Patrick CAROLL (INM – Montpelier) Rapporteur
Emanuel BOURINET (IGF - Montpelier) Rapporteur
Patrick DELMAS (CNRS - Marseille) Examinateur
Aziz MOQRICH (IBDML - Marseille) Directeur de thèse
Serge ALONSO (IBDML - Marseille) Co-directeur de thèse
AVANT-PROPOS

Cette thèse a été réalisée au sein du laboratoire d’Aziz MOQRICH et financée par une
bourse libanaise complétée du fond propre du laboratoire et par deux bourses d’un an chacune
obtenues à travers la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) et l’Association pour la
Recherche sur le Cancer (ARC).
En premier lieu, je voudrais remercier mon directeur de thèse, Aziz MOQRICH, pour
m'avoir donné l’opportunité de plonger dans le monde de la recherche. Je tiens également à le
remercier pour l’attention, le soutien et la confiance qu’il m’a témoignés au cours de ces
quatre années de thèse.
J’exprime ma profonde reconnaissance à Serge ALONSO qui a activement contribué à
la correction de ma thèse. Je le remercie vivement pour tous ses conseils, sa bonne humeur et
sa patience.
Je tiens à exprimer mes plus sincères remerciements aux membres de jury, qui ont
accepté d’évaluer mon travail de thèse : Keith DUDLEY, pour avoir accepté de présider le
jury de cette thèse ; Patrick CAROLL et Emmanuel BOURINET pour avoir accepté d’être les
rapporteurs de ce manuscrit. Merci également à Patrick DELMAS pour avoir accepté
d’examiner mon travail et de faire partie de mon jury de thèse.
Je remercie vivement Pascale MALAPERT, pour toute son aide, ses explications sa
disponibilité et sa gentillesse.
Toute ma gratitude à tous les membres de l’équipe, Eduardo GASCON (dit Eduarda :
mon idole), Stéphane GAILLARD, Svetlana GOROKHOVA, Marie-Claire DELFINI,
Annabelle MANTILLERI, Irène MARICS. Je les remercie pour leurs aides, leurs conseils et
leurs soutiens sans faille.
Je remercie également tous les stagiaires qui ont partagé avec nous quelques moments
de bonheur et de recherche et je leur souhaite bonne continuation.
Toute ma gratitude à mes collègues thésards de l’IBDML et si particulièrement à:
Hervé FARALLI (dit la torche), Sébastien SENATORE, et plein d’autres…….
Merci également à mes amis Tammam, Badr, Hany, Hassan, Mahmoud, Omar,
Bassem, et je leur souhaite une bonne continuation et bonne chance dans leur vie personnelle
et professionnelle.
Toutes mes pensées vont à ma mère, mon père, mes sœurs et mon frère ainsi que tous
mes proches pour leur soutien illimité malgré la distance et les problèmes.
1
ABBREVIATIONS

ATP: adenosine 5'-triphosphate
BCIP: 5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolyphosphate p-Toluidine Salt
BMP: bone morphogenetic protein
cAMP: cyclic adenosine monophosphate
CGRP: calcitonin gene-related peptide
CRD: cystein rich domain
DIG: diacylglycerol
DRG: dorsal root ganglia
DRG11: developmentally-regulated GTP-binding protein 11
DTT: dithiothreitol
FGF: fibroblast growth factor
FRS2: fibroblast growth factor receptor substrate 2
GDP: guanosine diphosphate
Grb2: growth factor receptor bound-protein 2
GTP: guanosine triphosphate
HGF: hepatocyte growth factor
IB4: isolectin B4
MAPK: mitogen-activated protein (MAP) kinases
MEC: mucosae-associated epithelial chemokine
MRG: Mas-related gene
NBT: Nitro-Blue Tetrazolium Chloride
NC: neural crest
NCC: neural crest cell
Néo: néomycine
NGN: neurogenenin
NOT: notochord
NT: neural tube
NTs: neurotrophines
PCR: polymerase chain reaction
P2X3: purinergic receptors subunit-3
PI3K: phosphoinositide 3-kinases
PLCᵧ: phospholipase C gamma
2
PV: parvalbumin
RA: retinoic acid
RT-PCR: reverse-transcriptase polymerase chain reaction
SOS: son of sevenless
SOX10: SRY-box containing gene 10
SPIN90: SH3 protein interacting with Nck (90Kda)
STAC: protein consisting of a Src homology Three And a Cysteine-rich domains
TNT: Tris NaCl Tween 20
TRAAK: TWIK-related arachidonic acid-stimulated potassium channel
TREK : TWIK-related potassium channel
TRIP6: thyroid receptor interacting protein 6
TYR: tyrosinase














3
SOMMAIRE

Avant propos 1

Abréviations 2

Introduction 7

Chapitre 1 : établissement de la diversité neuronale dans le DRG 11
1.1 origine embryonnaire de l’hétérogénéité neuronale 12
1.2 programmes transcriptionnels mis en place durant la neurogénèse 15
1.3 les récepteurs aux neurotrophines comme marqueurs précoces de la
spécification des neurones sensoriels somatiques 18
1.4 les facteurs de transcription de la famille Runt en haut de l’hiérarchie dans la
spécification tardive des neurones sensoriels somatiques 20
1.5 les modalités sensorielles périphériques et leurs récepteurs 25
1.5.1 sensibilité mécaniques et mécanorécepteurs 26
1.5.2 proprioception et propriocepteurs 28
1.5.3 sensibilité thermique et thermorécepteurs 29

Chapitre 2 : le système nociceptif périphérique 31
2.1 les nocicepteurs 33
2.2 sensibilité périphérique et inflammation 34
2.3 nociception et douleur neuropathique 36
2.4 mécanismes moléculaires de la sensibilisation et de l’activation des
nocicepteurs 38
2.4.1 les récepteurs de type TRP (Transient Receptor Potential) 38
2.4.2 les canaux sodiques voltage-dépendants 39
2.4.3 les récepteurs à l’acidité ou les ASICs (Acid Sensing Ionic Channel) 41
2.4.4 récepteurs des médiateurs inflammatoire 42
2.4.5 d’autres récepteurs des médiateurs inflammatoires : les récepteurs
neuropeptidiques 43

Chapitre 3 : les récepteurs neurotrophiques et les différentes voies de signalisation 45
3.1 la structure des Trks 47

4
3.2 les voies de signalisation des récepteurs neurotrophiques 49
3.2.1 la voie Ras-MAPK 51
3.2.2 la voie PI-3 Kinase 53
3.2.3 la voie PLC- γ 54

Problématique 56

Matériels et méthodes 59

1. animaux 60
2. Perfusion, dissection et préparation des spécimens 61
2.1 préparation des embryons 61
2.2 dissection des DRGs et du cerveau 62
3. préparation des sondes ARN 62
4. hybridation in situ 64
5. immunohistochimie 65
6. comptage 66
7. extraction d’ARN 66
8. RT-PCR 67
9. test de gradient thermique 68
10. test de choix entre deux températures (two temperatures test choice) 68
11. test nociceptif de la plaque chaude et de la plaque froide 69
12. test de stimulation mécanique dynamique de Von Frey 69
13. test de stimulation thermique plantaire (Hargreaves test) 69
14. stimulation thermique au niveau de la queue (tail flick test) 70

Résultats 71

Chapitre 1 : identification des protéines STACs comme marqueurs de deux classes distinctes
de neurones sensoriels somatiques 72
· Introduction article 1 73
· Article 1 75
· Complément de résultats article 1 103
1. stac2 est exprimé ailleurs que dans le DRG 104

5
Chapitre 2 : invalidation génétique de stac2 et analyse moléculaire et comportementale 107
1. génération de la souris stac2 KO 108
2. étude moléculaire de l’inactivation de stac2 dans le DRG 111
3. analyse comportementale des souris stac2 KO 113
3.1 test de gradient thermique 114
3.2 test de choix entre deux températures (two température test choice) 116
3.3 réponse thermique nociceptive des souris stac2 KO 120
3.3.1 réponse au froid nocif 121
3.3.2 réponse au chaud nocif 123
3.3.2.1 test de la plaque chauffante 123
3.3.2.2 test de stimulation de la queue de souris (tail flick) 124
3.3.2.3 test analgésique plantaire (test de Hargreaves) 125
3.4 réponse des souris stac2 KO à la stimulation mécanique (Von Frey test) 127

Chapitre 3 : identification de potentiels partenaires protéiques de STAC2 132
1. utilisation du système SRS 136
2. le système Gal4 138

Discussion 140

Conclusion et perspectives 147

Bibliographie 150









6









Introduction











7
Le système nerveux veille et contrôle la manière dont le corps interagit avec son
environnement. De multiples informations, internes et externes, captées par les cellules du
système sensoriel, seront traitées par le système nerveux central puis traduites avant de
déclencher une réponse. Pour cela, le corps dispose de deux systèmes : le système nerveux
central et le système nerveux périphérique. D’un point de vue fonctionnel, le système nerveux
périphérique est réparti en deux catégories : le système nerveux végétatif, dit autonome, qui
contrôle les fonctions vitales (respiration, digestion, fréquence cardiaque,….) et le système
nerveux somatique qui assure l’équilibre entre le corps et son environnement et qui est chargé
de collecter toutes les informations sensorielles périphériques. Ces informations comme le
toucher, la douleur, la posture et la température sont sélectivement détectées par les neurones
sensoriels somatiques. Ces neurones ont leur corps cellulaire englobé dans les ganglions de la
racine dorsale (DRG) au niveau du tronc et dans les ganglions trijumeaux au niveau de la tête.
Ils sont généralement divisés en quatre grandes catégories: les mécanorécepteurs (pression),
les thermorécepteurs (température), les propriocepteurs (la posture) et les nocicepteurs (la
douleur). Les études électrophysiologiques ont, depuis près d’un siècle, mis en évidence une
très grande hétérogénéité fonctionnelle de ces neurones (Scott, 1992a). Par contre, on connaît
très peu sur leur caractérisation moléculaire. A mon arrivée, le laboratoire du Dr Moqrich
venait à peine de s’installer dans le cadre d’une création d’une jeune équipe ATIP. L’objectif
principal de cette équipe consiste à comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent
la diversité fonctionnelle des neurones du système nerveux sensoriel somatique au niveau des
DRGs. Pour le faire, le Dr Moqrich a mis en place une approche pluridisciplinaire combinant
des analyses transcriptomiques à grande échelle, de la génétique de la souris, de la biologie
moléculaire et de la biochimie, de la physiologie et des études comportementales.
Les analyses transcriptomiques ont mis en évidence plusieurs candidats dont l’expression
spécifie des classes bien définies de neurones sensoriels somatiques. Parmi ces candidats, une
8
protéine adaptatrice potentielle de fonction encore inconnue, la protéine STAC. STAC a été
décrite pour la première fois par Suzuki et al en 1996 comme étant une protéine adaptatrice
potentielle exprimée de façon prépondérante dans plusieurs régions du cerveau embryonnaire
et se restreint à quelques structures cérébrales de cerveau de souris adulte, notamment au
niveau du cervelet. L’analyse de la séquence peptidique primaire de cette protéine révèle trois
domaines connus pour leur implication dans des interactions protéine-protéine : un domaine
riche en Cystéine (CRD) et deux domaines SH3. Les expériences de transcriptome nous ont
révélés stac comme étant très fortement exprimée dans les neurones nociceptifs. L’analyse
bioinformatique de la séquence de STAC nous a permis d’identifier deux autres protéines
STAC que nous avons nommées STAC2 et STAC3. Stac2 est exprimé dans les neurones
sensoriels somatiques alors que stac3 a montré une expression préférentielle dans le muscle
squelettique. Au niveau des neurones sensoriels somatiques, stac1 et stac2 ont une expression
très dynamique au cours du développement et lors de la maturation postnatale. Mon travail de
thèse a consisté à contribuer à l’élucidation du rôle de la protéine STAC2 dans le
développement, la maturation ainsi que dans la fonction des neurones sensoriels somatiques
qui l’expriment. Dans cette optique, mon introduction sera divisée en trois chapitres. Dans le
premier chapitre, je vais commencer par aborder les événements développementaux précoces
tout en se focalisant sur l’origine embryonnaire des précurseurs neuraux des neurones
sensoriels somatiques, un deuxième volet sera consacré aux différents programmes
transcriptionnels activés pour mettre en place l’hétérogénéité du système nerveux sensoriel
somatique. Ensuite suivra un aspect nouveau dans le domaine qui concerne le développement
postnatal des neurones nociceptifs. Dans le second chapitre, je vais m’intéresser au système
nociceptif périphérique proprement dit en fournissant une vue générale sur les acteurs majeurs
impliqués dans les différents mécanismes périphériques de la nociception, comment le
système nociceptif peut être modulé et sensibilisé ? Et enfin dans le troisième chapitre je
9

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