Development of mRNA patterns for screening of anabolic steroids in bovine and primate tissues [Elektronische Ressource] / Irmgard Riedmaier

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2009
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• Langue: Deutsch
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Extrait

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Lehrstuhl für Physiologie
Development of mRNA patterns for screening of anabolic steroids in
bovine and primate tissues
Irmgard Riedmaier
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München
zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. M. Klingenspor
Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. H. H. D. Meyer
2. Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. J. Bauer
3. Priv.-Doz. Dr. M. W. Pfaffl
Die Dissertation wurde am 16. 03. 2009 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 23. 07. 2009 angenommen.Contents
Table of Contents
Abbreviations...........................................................................................................ii
Zusammenfassung.................................................................................................iv
Abstract .................................................................................................................. vi
1 Introduction................................................................................................ 1
1.1 Anabolic Steroid Hormones – use and misuse in animal husbandry.............. 1
1.2 Steroid Hormones in Hormone Replacement Therapy................................... 1
1.3 Potential of transcriptomics for biomarker development to trace anabolic
steroid hormone functions ............................................................................. 2
1.4 Aims .............................................................................................................. 4
2 Materials and Methods .............................................................................. 5
2.1 Animal Experiments....................................................................................... 5
2.2 RNA Extraction and Quality Determination .................................................... 8
2.3 Selection of Target Genes ............................................................................. 9
2.4 Specific Primer Design .................................................................................13
2.5 Two-Step RT-qPCR Analysis........................................................................13
2.6 One-Step RT-qPCR Analysis........................................................................14
2.7 Data Analysis and Statistics..........................................................................15
3 Results and Discussion ...........................................................................17
3.1 Anabolics study on Nguni Cattle...................................................................17
3.2 Pour on anabolics study in veal calves .........................................................25
3.3 SARM Study on Macaca fascicularis ............................................................29
4 Conclusions and Perspectives................................................................34
5 References ................................................................................................37
Acknowledgements ...............................................................................................46
Scientific Communication ......................................................................................47
Curriculum Vitae....................................................................................................49
Appendix ...............................................................................................................50
iAbbreviations
Abbreviations
aCP1 acid phosphatase 1 GR glucocorticoid receptor
ACTA2 actinα 1 HRE hormone responsive element
ACTB actinβ IFN interferone
ADRBK2 adrenergic β kinase 2 IGF-1 insulin like growth factor 1
AR androgen receptor IGF-1R insulin like growth factor 1
BCL-2 B-cell CLL/lymphoma 2 receptor
BCL-XL B-cell lymphoma extra large IGFBP3 insulin like growth factor binding
bp base pairs protein 3
C control IL interleukin
Casp caspase LAP lingual antimicrobial peptide
CC carrier control LTF lactoferrin
cDNA complementary DNA MGA melengestrolacetate
CK creatine kinase MHC major histocompatibility complex
CK8, 18 cytokeratin kinase 8, 18 mRNA messenger RNA
CP2 transcription factor CP2 MTPN myotropin
Ct threshold cycle NTC no template control
DEGMBE diethylenglycolmonobutylether OD optical density
DMSO dimethylsulfoxid PCA principle components analysis
DNA desoxyribonucleic acid PCR polymerase chain reaction
dNTP desoxyribonucleosidtriphosphate pmol picomol
EGF epidermal growth factor PR progesterone receptor
EGFR epidermal growth factor receptor RT-qPCR quantitative reverse transcription-
EITR estrogen induced transcription polymerase chain reaction
factor RBM RNA binding protein
ER estrogen receptor rev reverse
Fas TNF receptor superfamily RG reference gene
member 6 RIN RNA integrity number
FasL TNF receptor superfamily RNA ribonucleic acid
member 6 ligand RSA Republic of South Africa
FGF fibrobast growth factor RT reverse transcription
FGFBP fibrobast growth factor binding SARM selective androgen receptor
protein modulator
for forward SD standard deviation
GAPDH glycerinealdehyde-3-phosphate SERM selective estrogen receptor
dehydrogenase modulator
iiAbbreviations
T1 one time treated group
T3 three times treated group
TBA trenbolone acetate
Testo testosterone
TGF tumor growth factor
TMOD tropomodulin
TNF tumor necrose factor
TNFR tumor necrose factor receptor
UB3 ubiquitin 3
USF upstream transcription factor
YWHAZ tyrosine 3-
monooxygenase/tryptophan 5-
monooxygenase activation
protein, ζ polypeptide
iiiZusammenfassung
Zusammenfassung
Natürliche Steroidhormone werden ausgehend von Cholesterin gebildet und sind in die
endo- und parakrine Wachstumsregulation verschiedener Gewebe involviert. Einzelne
Steroidhormone, wie Östrogene und Androgene wirken anabol, indem sie die
Proteinretention im Körper verbessern und Fettreserven abbauen, was zu einer Erhöhung
der Wachstumsrate führt. In der Tiermast werden diese anabolen Eigenschaften genutzt,
um die Gewichtszunahme und die Futterverwertung zu verbessern, womit die
Produktivität erhöht und Kosten gesenkt werden.
In einigen Ländern, wie den USA, Kanada, Australien, Mexiko und Südafrika ist der
Gebrauch von Wachstumsförderern in der Tiermast zugelassen. Aufgrund erwiesener
Nebenwirkungen für den Konsumenten ist der Gebrauch anaboler Substanzen in der EU
verboten, wo die Einhaltung dieser Richtlinie (88/146/EEC) streng überwacht wird.
Ein weiteres Anwendungsgebiet anaboler Steroidhormone ist die Behandlung
altersbedingter Krankheiten, wie Osteoporose oder Sarkopenie, welche durch eine
Abnahme der endogenen Produktion von Östradiol und Testosteron bei rückläufiger
Gonadenfunktion verursacht werden. Für die Behandlung dieser altersbedingten
Krankheiten wurden so genannte selektive Androgen Rezeptor Modulatoren (SARM)
entwickelt. Darunter versteht man synthetische Moleküle, welche die nützlichen zentralen
und peripheren Eigenschaften von Testosteron besitzen, jedoch kaum Nebenwirkungen
aufweisen. Aufgrund der positiven Wirkungen eines SARM auf die Muskelmasse ist das
Risiko des Missbrauchs dieser Substanzen in der Tiermast oder im Sport vorhanden.
Um den Missbrauch anaboler Substanzen in der Tiermast oder im Sport zu kontrollieren,
werden Hormonrückstände mittels Immunoassays oder chromatographischer Methoden in
Kombination mit Massenspektrometrie detektiert. Mit Hilfe dieser Methoden können nur
bekannte Substanzen nachgewiesen werden. Um eine effiziente Kontrolle des
Missbrauchs anaboler Stoffe zu gewährleisten, ist es nötig neue Technologien zu
entwickeln, mit welchen man den Gebrauch einer breiten Masse an illegalen
Medikamenten, inklusive neu entwickelter Xenobiotika nachweisen kann.
Ein Ansatz zur Entwicklung einer neuen Nachweismethode ist das Aufzeigen
physiologischer Effekte, welche durch die Einnahme anaboler Substanzen verursacht
werden. Ein viel versprechender Weg solche physiologischen Veränderungen
nachzuweisen, ist die Bestimmung von Veränderungen in der mRNA Expression mittels
quantitativer real-time RT-PCR (RT-qPCR).
Ziel dieser Arbeit war es zu prüfen, ob die Bestimmung von
Genexpressionsveränderungen Potential für die Entwicklung neuer Technologien zum
Nachweis missbräuchlicher Anwendung anaboler Substanzen hat. Hierfür wurde die
ivZusammenfassung
mRNA Expression steroidabhängiger Gene im Blut und in vaginalen Epithelzellen –
Gewebe, welche leicht vom lebenden Individuum genommen werden können - mittels RT-
qPCR quantifiziert und mögliche Veränderungen statistisch bewertet.
In allen drei Tierversuchen, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden, konnten
Genexpressionsveränderungen festgestellt werden. In zwei dieser Studien konnte aus
den signifikant regulierten Genen mit Hilfe biostati