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Etude de l'interaction des complexes respiratoires avec les coenzymes membranaires : le cas de la Nitrate réductase chez Escherichia coli, Study of the interaction of respiratory complexes with their membrane coenzymes : the case of the Escherichia coli Nitrate reductase A

De
336 pages
Sous la direction de Axel Magalon
Thèse soutenue le 06 mars 2010: Aix Marseille 2
Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l'interaction du complexe Nitrate Reductase A (NarGHI) avec les quinones et les lipides de la membrane chez E. coli. Nous avons identifié que les intermédiaires ménasmiquinones interagissent avec une liaison hydrogène avec l'histidine 66 du site Qd. Par ailleurs, nous avons mis en évidence par la fixation spécifique d'une molécule de cardiolipine est indispensable au fonctionnement du complexe NarGHI en permettant la fixation du quinol. Enfin, nous avons démontré l'existence d'une liaison fonctionnelle entre la voie de biosynthèse des hèmes et les complexes respiratoires via la protéine HemG, qui couple la réduction des quinones avec l'oxydation du protoporphyrinogène IX. Ces éléments prouvent qu'une voie catalytique peut contribuer à la synthèse ATP. L'ensemble de ces résultats indique une étroite interconnexion physique et fonctionnelle entre tous les éléments qui composent la membrane cytoplasmique d'E. coli
-Escherichia coli
-Quinone
-Cardiolipine
-Heme
In this thesis, I study the interaction between the nitrate reductase A comlex (NarGHI) with the quinines and lipids of the E. coli cytoplasmic membrane. We demonstrate that His66 present at the Qd site is directly hydrogen bonded to both menasemiquinone and ubisemiquinone species. In addition, we show that functionning of the enzyme complex is controlled by cardiolipin binding in a specific cavity allowing quinol binding at the nearby QD site. Finally, we relealed that heme biosynthesis is a quinone-depended metabolic reaction during anaerobic growth of E. coli, in wich the HemG protein will direct electron transfer issued from oxidation of a heme biosynthetic intermediate towards quinone molecules via interaction between quinones, lipids and membrane- associated complexes that couple respiration and anabolic pathways to ATP generation in specialized domains of E. coli membrane
-Respiratory Complex
-Escherichia coli
-Nitrate reductase
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22026/document
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Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II
Thèse
Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de la Méditerranée
Microbiologie Moléculaire et Biotechnologies
Etude de l’interaction des complexes respiratoires avec les
coenzymes membranaires : le cas de la Nitrate réductase chez
Escherichia coli
Rodrigo Arias Cartín
Présentée et soutenue publiquement le 16 Mars 2010
Devant le jury composé de
Pr. Frédéric Barras Président du jury
Dr. Jean-Jaques Lacapère Rapporteur
Dr. Fabrice Rappaport Rapporteur
Pr. Bruno Guigliarelli Examinateur
Dr. Stéphane Grimaldi Examinateur
Pr. James Sturgis Examinateur
Dr. Axel Magalon Directeur de thèse

Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier Messieurs Jean-Jacques Lacapère et Fabrice
Rappaport, de m’avoir fait l’honneur d’être rapporteurs ainsi que James Sturgis pour avoir
bien voulu examiner ce travail.
Je remercie Frédéric Barras pour m’avoir accepté dans le Laboratoire de Chimie
Bactérienne et de m’avoir fait l’honneur de présider ce jury. Merci pour les discussions
philosophiques et pour ton humeur qui ont fait du congrès GFB à Clermont-Ferrand un très
bon souvenir.
Je remercie Bruno Guigliarelli pour m’avoir permis de travailler dans son laboratoire
ainsi que pour le temps qu’il a consacré à m’expliquer la RPE. Merci également à Pascal
Lanciano et Stéphane Grimaldi pour l’amitié qu’ils m’ont témoignée et qui ont toujours
détendu l’atmosphère dans les moments difficiles et périlleux des titrages potentiométriques.
Travailler avec vous a toujours été un plaisir.
Je souhaite remercier tout particulièrement Axel Magalon pour m’avoir accueilli dans
son équipe puis accompagné pendant un peu plus de trois années inoubliables. Je te remercie
de ta patience, sympathie et générosité. Je t’exprime toute ma reconnaissance pour m’avoir
encouragé et fait profiter de ton savoir mais surtout pour ton amitié et celles de Karine et
Fiona.

Maintenant je m’adresse à l’ensemble de l’équipe Magalon pour m’avoir enseigné les
pratiques locales et les subtilités de la langue française. Mais également pour avoir fait
l’effort de décrypter mon franspagnol qui a parfois était source de franches rigolades. A
Janine « Jane » et René, un grand merci pour votre aide incalculable et pour avoir été le
phare qui m’a éclairé la route tortueuse de la biochimie. Gérard, je te remercie de ta
sympathie et de ton altruisme au laboratoire et au bateau, toujours avec une tasse de café en
plus pour moi, j’espère un jour te voir à la pèche dans le Pacifique costaricien. Silva, merci
pour avoir partagé avec nous ta joie de vivre et tes talents culinaires (gâteaux chocolat-
banane et friandises libanaises). Merci Rémi de ta bonne humeur et de toujours nous tenir au
courant de la tendance « fashion ». Anne avec qui j’ai partagé en plus du bureau une belle
amitié, je te remercie profondément de ton soutien et ton écoute. Notre petit café quotidien me
manque déjà. A Léa, la toute dernière arrivée, je te remercie de ta sympathie et de ton
dynamisme qui fait bouger l’équipe. A Pierre, je te souhaite bonne chance pour la suite
puisque tu reprends le flambeau de mon projet de thèse. Je remercie aussi Francis Blasco
pour ses conseils et avec qui j’ai eu le plaisir de parler en espagnol.

Un grand merci à tous les amis qui se trouvent encore ici à l’institut ou qui sont déjà
partis pour de nouvelles aventures. Particulièrement à Rémi, Raïssa, François, Marion,
Cindy et Magali. Je remercie tous les gens du « sous sol » pour leur accueil et leur bonne humeur, spécialement Maryline Foglino et Annick Guiseppi pour toute leur aide et gentillesse
depuis mon arrivée au laboratoire il y a 5 ans. Je remercie Anne Galinier pour ses
inestimables conseils sur la fluorescence et d’avoir accepté d’être ma marraine de thèse. Alex
et Benji, merci de votre précieuse amitié et de tous les moments agréables qui nous avons
partagé ensemble.

Il me faudrait de nombreuses pages pour remercier ma deuxième famille ici en
France. Grâce à votre accueil et générosité j’ai pu m’intégrer et profiter de ce pays. Un
grand merci à Michèle et Christian, Philippe et Vanessa, Domi et Bobo ainsi qu’Amandine et
Nicolas et tous les petits.
Ahora me toca hablar en español para agradecer a mi primera familia esa que me vió
nacer y crecer y que ha estado siempre conmigo, incluso desde lejos. Gracias papá y mamá
por todo el amor me dieron y el esfuerzo que hicieron para darme lo mejor. Siempre fueron,
son y serán para mí un ejemplo de esfuerzo, perseverancia, honestidad y generosidad.
Ustedes me enseñaron que con trabajo y tenacidad todo es posible. Mamá nunca te olvidaré.
Tati vos has sido una hermana y una amiga, gracias por todas esas palabras de apoyo y esos
gestos tan generosos, tus llamadas siempre me han llenado de alegría. Pablo mi hermano,
espero que algún día yo pueda tener tu paciencia y voluntad, estoy seguro que aún tengo
mucho que aprender de vos.
Sonia mi esposa, no puedo expresar con palabras toda la gratitud que te tengo. Esta
tesis no la hice yo sólo, la hicimos los dos juntos. Tu apoyo y paciencia siempre han sido
fundamentales para mi éxito. Norita, tu sonrisa me motiva a trabajar duro cada día.
A ustedes dos les dedico este libro,
Rodrigo
« Caminante, son tus huellas
el camino y nada más;
Caminante, no hay camino,
se hace camino al andar.
Al andar se hace el camino,
y al volver la vista atrás
se ve la senda que nunca
se ha de volver a pisar.
Caminante no hay camino
sino estelas en la mar»
Antonio Machado


SOMMAIRE
Introduction bibliographique 2
Chapitre I: Lipids, quinones and proteins in Energy Transducing
Membranes (ETM) 4
I.A Lipids in ETM 8
I.A.1 Glycerophospholipids 10
I.A.2 Glycoglycerolipids 12
I.B Quinones 14
I.C Proteins in ETM implicated in oxidative phosphorylation 16
I.C.1 Integral membrane proteins 16
I.C.1 Peripheral membrane proteins 18
I.D ETM architecture 18
Chapitre II: Energy Transduction and Respiratory Complexes 22
II.A Oxidative Phosphorylation 24
II.B Chemiosmotic Theory 24
II.C Proton Translocation by redox loops and proton pumps 26
II.C.1 Redox loops 26
II.C.2 Proton pumps 28
II.D Mitochondrial Respiratory Chain 28
II.D.1 Complex I 30
II.D.1.1 Quinone binding site in Complex I 32
II.D.2 Complex II 34
II.D.2.1 Quinone binding site in Complex II 34
II.D.3 Complex III 38
II.D.3.1 Quinone binding site Q in Complex III 40 0
II.D.3.2 Quinone binding site Q in Complex III 44 i
II.D.4 Complex IV 48
II.E Prokaryotic Respiratory Chains 50
II.E.1 Aerobic and Anaerobic Respiration in E. coli 50
II.F Nitrate Respiration in E. coli 54
II.F.1.Nitrate Reductase-Formate Dehydrogenase Redox Loop 56
II. F.2 Nitrate Reductase A complex 58
II.F.2.1 NarG subunit 58
II.F.2.2 NarH subunit 60
II.F.2.3 NarI subunit 62
II.F.3 NR Quinone binding site and semiquinone 64
Chapitre III: Mitochondrial, gram negative and gram positive bacteria
membranes 72
III.A Mitochondria 74
III.A.1 Inner Mitochondrial Membrane 76
III.A.2 Organization of the mitochondrial respiratory chain 78
III.A.3 Mitochondrial Supercomplexes 80
III.A.4 Quinone pool 84
III.A.5 Role of lipids in mitochondria respiratory complexes and
supercomplexes 86
III.B Gram negative and Gram positive bacteria 92
III.B.1 Cytoplasmic membrane of E. coli and B.subtilis 92
III.B.1.1 Lipid domains in E. coli and B. subtilis 92
III.B.1.2 Physiological role of lipids in E.coli and B. subtilis 96
III.B.1.3 Role of lipids in E. coli Respiratory Complexes 100
III.C Prokaryotic supercomplexes 102
III.D Lipid binding sites in X-ray structures of respiratory complexes 104
III.D.1 Cardiolipin binding sites in Complex III 106
III.D.2 Structures of E. coli membrane-bound Respiratory
Complexes 108
III.D.2.1 Succinate dehydrogenase and Fumarate reductase 108
III.D.2.2 Formate Dehydrogenase N 108
III.D.2.3 Nitrate Reductase A 108

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