Étude du trafic polarisé de la sous-unité GluK3 des récepteurs du glutamate de type kaïnate

Déborah Huyghe

Description

Sous la direction de Françoise Coussen
Thèse soutenue le 18 décembre 2009: Bordeaux 2
Les récepteurs du glutamate de type kaïnate (KAR) jouent une grande variété de rôles dans la régulation de l’activité des réseaux neuronaux. Les KARs sont localisés à la fois dans les domaines pré- et postsynaptiques et sont impliqués dans différents rôles physiologiques tels que la libération de neurotransmetteur, le contrôle de l’excitabilité neuronale. ainsi que l’intégration et la plasticité synaptique (Pinheiro et Mulle 2006). Mon sujet de thèse a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans le trafic subcellulaire et de l'expression polarisée des récepteurs de type kaïnate contenant la sous-unité GluK3. J’ai d’abord essayé de trouver des protéines associées, cytoplasmiques, qui pourraient intervenir dans le trafic de ces récepteurs. Les approches de protéomique que j’ai utilisées n’ont pas donné de résultat. J’ai ensuite tenté de produire des anticorps dans le but de visualiser ces récepteurs dans le cerveau. Malheureusement, je n’ai pas obtenus d’anticorps suffisamment affins pour réaliser ce projet. Par des approches de mutagénése dirigée et d’expression des récepteurs recombinants dans des systèmes hétérologues ou dans des neurones d’hippocampe en culture, j’ai pu mettre en évidence que la sous-unité GluK3 est endocytée par la voie dépendante de la clathrine via un motif di-leucine cytoplasmique. L'endocytose des récepteurs est régulé par l'application d'acide kaïnique et permet une expression polarisée de GluK3b dans les dendrites. Nous avons ensuite développé un projet d'étude du trafic des récepteurs de type kaïnate hétéromériques composés des isoformes GluK3a et GluK3b. Ce projet est actuellement en cours, mais des données préliminaires semblent impliquer la sous-unité GluK3a dans le processus d'exocytose des récepteurs. Il est donc possible que l’association des deux isoformes serait nécessaire au contrôle de l'expression membranaire du récepteur (via GluK3a) et à l'adressage polarisé dans les neurones (via GluK3b). Cette hypothèse doit cependant être encore validée.
-Récepteur de type kaïnate
-Sous-unité GluK3 (GluR7)
-Trafic protéique
-Polarité neuronale
Glutamate is the principal excitatory neurotransmitter in the brain. Glutamatergic synaptic transmission is mediated by three types of ionotropic receptors that have been classified according to their preferential affinity for the agonists NMDARs (N- methyl-D-aspartate receptors), AMPARs (a-amino-3-hydroxy- 5-methylisoazol-4- propionate receptors) and KARs (kainate receptors). Kainate receptors (KARs) are widely expressed in the brain and are present both at pre- and postsynaptic sites and are involved in several physiological functions. There are five subunits of KAR (GluR5-7, KA1 and KA2 or GluK1-5). One of the main project of my laboratory is to understand the function, the traffic and the regulation of GluK3 subunit, that has been involved in different neuronal desorders such as schizophrenia and depression. GluK3(GluR7)-containing KARs are thought to compose pre-synaptic autoreceptors that facilitate hippocampal mossy fiber synaptic transmission. There are two splice variants of GluK3, named GluK3a and GluK3b . GluK3a shares the same export motif as GluK2a in its C-terminal cytoplasmic domain which allows high expression at the plasma membrane in heterologous cell systems and in primary cultured neurons. In contrast, GluK3b seems to be retained in the endoplasmic reticulum (ER) and is only detected at the plasma membrane in substantial amounts when co-expressed with GluK3a. In my thesis, I have been interested in the mechanisms of polarized trafficking of GluK3 with a main focus on GluK3b. I have been able to identify molecular mechanisms that underlie the polarized trafficking of KARs composed of the GluK3b splice variant. Endocytosis followed by degradation is driven by a di-leucine motif on the cytoplasmic C-terminal domain of GluK3b both in heterologous cells and in cultured hippocampal neurons. The internalization of GluK3b is clathrin and Dynamin2 dependent. Moreover, endocytosis of GluK3b in neurons is regulated by bath application of the KAR agonist kainate. Interestingly, the preferential subcellular localization of GluK3b in dendrites or axons depends on the endocytotic process. We submitted a paper to J. of Neurosciences that show that the subcellular localization of GluK3b depends on the dynamic regulation of an endocytic process that could control the polarized trafficking of KARs in neurons in an activity- dependent manner. I also developped a second project focus on the traffic of KARs expressed as heteromers (GluK3b assembled with GluK3a). I am actually working on this project in my lab in order to send a second paper in the next months.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21686/document

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 64
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 8 Mo

Extrait

Université Victor Segalen Bordeaux 2
Année 2009
THÈSE
pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Neurosciences et Pharmacologie

Présentée et soutenue publiquement
Le 18 Décembre 2009
Par Déborah HUYGHE
Née le 22 Décembre 1982 à Bordeaux


Étude du trafic polarisé de la sous-unité GluK3 des
récepteurs du glutamate de type kaïnate



Membres du Jury
DARGENT Bénédicte Directeur de Recherche CNRS Rapporteur
FAIVRE-SARRAILH Catherine Directeur de Recherche CNRS Rapporteur
LANG Jochen Professeur Université Bordeaux 1 Examinateur
MARTIN Stéphane Chargé de recherche CNRS Examinateur
COUSSEN Françoise Chargé de Recherche CNRS Directeur de thèse








Je croyais bien faire. Mais rien ne va jamais comme prévu. Et c’est bien naturel car l’homme
n’est par définition que l’ambition d’être un autre. Un autre mieux. Et puisque qu’il, nous,
sommes destinés, par notre nature même, à rester insatisfaits des autres et de nous-mêmes,
comment espérer jamais une satisfaction durable ? Le monde et ce que l’on peut en obtenir
n’étant qu’éphémère et voué à la destruction, j’affirme ici que l’aspiration au bonheur n’est
rien d’autre qu’un rêve inaccessible… et la science l’outil que j’ai trouvé pour ne jamais me
réveiller…
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REMERCIEMENTS
Je tiens avant tout à remercier les membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce travail et
m’honorent de leur présence : le Dr. J. Lang, le Dr. B. Dargent, le Dr. C. Faivre-Sarrailh et le
Dr. S. Martin.
Je remercie Christophe Mulle pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et dans son
équipe. Je le remercie aussi également pour les trois années écoulées dans un
environnement scientifique aussi stimulant et dans des conditions de travail aussi agréables.
Merci au Ministère de la Recherche et de l’enseignement supérieur et à la FRM pour le
soutien financier au cours de ces trois années.
Je remercie Françoise Coussen de m’avoir fait confiance et de m’avoir soutenue durant ces
trois années de thèse. Je ne saurais pas dire où commence et où s’arrête sa contribution à
la personne que je suis aujourd’hui, mais elle est à la hauteur des difficultés et des
satisfactions que nous avons partagées. C'est-à-dire, immense.
Merci aussi à… tout le monde. A tous ceux qui m’ont aidé dans mon projet, de près ou de
loin, je dédis ce modeste paragraphe. Je remercie tout spécialement David, qui, par son
écoute attentive et ses conseils judicieux, a contribué à l’avancement de mon projet. Merci
aussi à tous les interlocuteurs dont j’ai usé et abusé pour parler de mon projet : Christophe,
Agnès, Delphine, Peggy, Nelson, Mario, Eric, Béa, Magali…. Merci aussi à nos ingénieurs de
chocs, sans qui nous ne serions rien… merci aux ingénieurs de la PICIN pour leur aide
décisive, et merci aussi à Jérôme et Julie pour leur aide administrative et amicale.
Parce que, le 12 juillet 2008, il m’a fait une maxiprep du mutant 164, mais surtout parce qu’il
est lui, je remercie Poussin, alias Arnaud. Je remercie aussi les personnes qui m’ont rendu
ce laboratoire spécial et unique au monde : Johanna, Jessica, Shankar, Paulo, Fred, Lucie,
Damien, Julien, Julien, Ronan, Laure, Marie-Charlotte, Delphine, Helge, Virginie…
Merci à aussi à tous ceux qui étaient là sans y être et sans qui la vie serait bien triste :
Pascaline, Vanessa, Fred et mes super colocs bombasses que j’adore, Mélanie et Virginie.
Merci à ma famille, pour avoir été et être mes piliers sans plier. Et merci à toi.
3
SOMMAIRE


SOMMAIRE ............................................................................................................................. 4

RESUME................................. 6

INTRODUCTION ..................................................................................................................... 7
I. L’hippocampe : généralités.......................... 7
II. Les neurones............... 8
1) Généralités................................................................................................ 8
2) Trafic des protéines dans les neurones. 11
• Biosynthèse et maturation.................. 11
• Trafic entre le RE et l’appareil de Golgi ............................................................. 12
• Endocytose ........................................................................ 15
• Les voies d’endocytose...................................................... 17
• Recyclage et Dégradation.................................................. 22
• Expression polarisée des protéines neuronales................ 23
3) Les synapses ......................................................................... 26
• Les synapses électriques................................................... 26
• Les synapses chimiques.................................................... 26
• La synapse glutamatergique.............. 27
III. Les récepteurs du glutamate..................................................... 31
1) Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR)....... 31
2) Les récepteurs ionotropiques du glutamate (iGluR).............. 32
• Les récepteurs de type NMDA (NMDAR) .......................................................... 33
• Les récepteurs de type AMPA (AMPAR)........................... 34
3) Les récepteurs de type kaïnate (KAR)................................... 34
• L’acide kaïnique ................................................................. 35
• Physiopathologies des récepteurs de type kaïnate............ 35
• Clonage et structure des sous-unités des KAR ................................................. 36
• Pharmacologie des KAR .................................................... 37
• Propriétés électrophysiologiques des KAR recombinants ................................. 39
• Rôles des KAR dans la transmission synaptique............... 40
• Localisation ........................................................................ 42
4 IV. La sous-unité GluK3............................................................................................... 46
1) Historique ............................................. 46
2) Physiopathologies.. 49
3) Structure et caractéristiques cinétiques ................................................................. 50
4) Trafic ............................................. 51
• Mécanismes du trafic subcellulaire.... 51
• Trafic polarisé..................................................................... 52
• Mécanismes de régulation du trafic... 54

MATERIELS ET METHODES ............................................................................................... 55
I. Biologie Moléculaire................................... 55
II. Cultures cellulaires..... 55
III. Biochimie ................................................................................................................... 56
IV. Immunocytochimie et Imagerie.................. 59
V. Electrophysiologie...................................................................................................... 60

RESULTATS et DISCUSSION.............................. 62
I. Problématique............................................................................................................ 62
II. Projet 1 : Caractérisation des partenaires protéiques impliqués dans le trafic de la
sous-unité GluK3............... 63
III. Projet 2 : Etude du trafic polarisé des KAR contenant la sous-unité GluK3. ............. 65
1) Projet 2.1 : Etude de la localisation de la sous-unité GluK3 dans le cerveau........ 65
2) Projet 2.2 : Etude des mécanismes impliqués dans le trafic polarisé et subcellulaire
de la sous-unité GluK3. Article............................................................. 70
3) Projet 2.3 : Etude du trafic subcellulaire des KAR composés des isoformes GluK3a
et GluK3b. ................................ 96

PERSPECTIVES ................................................................................. 105

BIBLIOGRAPHIE................................................. 108


5 RESUME

Les récepteurs du glutamate de type kaïnate (KAR) jouent une grande variété de rôles dans
la régulation de l’activité des réseaux neuronaux. Les KARs sont localisés à la fois dans les
domaines pré- et postsynaptiques et sont impliqués dans