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Etude quantitative de la sécrétion de lipase, de la lipolyse et du stockage de lipides chez Yarrowia lipolytica lors de sa croissance en présence d'huile d'olive, Quantitative study of lipase secretion, extracellular lipolysis and lipid storage in the yeast Yarrowia lipolytica grown in the presence of olive oil

De
168 pages
Sous la direction de Frédéric Carriere
Thèse soutenue le 29 octobre 2010: Aix Marseille 2
La sécrétion de lipase, la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras (AGL) ont été étudiés chez Yarrowia lipolytica (YL) en présence d’huile d’olive et/ou de sucrose. Des mesures d’activité lipase et d’immuno-révélation ont montré que l’activité lipase présente dans le milieu de culture provenait principalement de la lipase YLLIP2. L’huile d’olive induit la production de lipase qui est principalement associée aux cellules pendant les premières heures de cultures. YLLIP2 est ensuite libérée dans le milieu de culture avant d’être totalement dégradée par les protéases. Les triglycérides (TG) sont dégradés alors que la lipase est encore attachée aux cellules. Les produits de lipolyse présents dans le milieu de culture et à l’intérieur des cellules ont été quantifiés par chromatographie TLC-FID et GC. Les niveaux intracellulaires d’AGL et de TG augmentent transitoirement et dépendent de la source de carbone utilisée. Une accumulation maximum de 37,8 % w/w de lipides est observée avec l’huile d’olive seule. Cette étude montre que la levure YL est un modèle intéressant pour étudier la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras par les cellules
-Acide Gras
-Métabolisme des Lipides
-Lipolyse
-Lipase
-Yarrowia lipolytica
-Levures
-Croissance Microbienne
-Triglycéride
-Cristallogenèse
-Inhibiteurs
Lipase secretion, extracellular lipolysis and fatty acid (FFA) uptake were quantified in Yarrowia lipolytica (YL) grown in the presence of olive oil and/or sucrose. Lipase assays and western blot analysis indicated that the lipase activity measured in YL cultures mainly resulted from YLLIP2 lipase. Lipase production was triggered by olive oil and YLLIP2 remained associated with the yeast cells during the first hours of culture. It was then released in the culture medium before it was totally degraded by the alkaline protease. Olive oil triglycerides (TG) were degraded when the lipase was still attached to the cell wall. The fate of lipolysis products in the culture medium and inside the yeast cell were investigated by quantitative TLC-FID and GC analysis. Intracellular levels of FFA and TG increased transiently and were dependent on the carbon sources. A maximum fat storage of 37.8% w/w was observed with olive oil alone. The present study shows that yeasts are interesting models for studying extracellular lipolysis and fat uptake by the cell
-Fatty acid
-Lipid metabolism
-Lipolysis
-Lipase
-Yarrowia lipolytica
-Microbial growth
-Triglyceride
-Yeast
-Crystallogenesis
-Inhibitors
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22100/document
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UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE (AIX-MARSEILLE II)
FACULTE DE SCIENCES DE LUMINY
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE



THESE


présentée par


Amal NAJJAR



pour obtenir le titre de


DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE

Discipline : Microbiologie et Biotechnologies


Etude quantitative de la sécrétion de lipase, de la lipolyse et du stockage de
lipides chez Yarrowia lipolytica lors de sa croissance
en présence d’huile d’olive.

Directeur de thèse : Dr. Frédéric CARRIERE


soutenue le 29 Octobre 2010 devant le jury


Rapporteurs Examinateurs

Dr. Elisée Ferré Pr. Jean-Louis Romette

Dr. Pierre Villeneuve Dr. Frédéric Carrière










A Michèle,
et aux enfants de la Palestine et de l’Iraq

Remerciements
Je tiens à exprimer tout d'abord mes remerciements aux membres du jury, qui m’ont fait
l’honneur de participer au jury de cette thèse. A M. Jean-Louis Romette, prof. à l’Université
Aix-Marseille II, je vous remercie d’avoir accepté de présider le jury de cette thèse. Merci à
M. Pierre Villeneuve, Dr. au Cirad Montpellier, et M. Elisée Ferré, MCF Université Aix-
Marseille III, d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ce manuscrit.

Merci à l’association Al-Sabat (Liban) pour avoir financé partiellement ma thèse.

A M. Frédéric Carrière, je voudrais adresser mes remerciements les plus sincères pour votre
patience, votre encouragement quotidien et vos conseils, me laissant la liberté nécessaire à
l'accomplissement des travaux de thèse, tout en y gardant un œil critique et avisé. Merci aussi
pour mon accueil au laboratoire, votre confiance et pour m’avoir délégué plusieurs
responsabilités dont l’organisation du journal club. Merci aussi pour m’avoir accordé un
complément financier afin d’effectuer ma thèse dans de meilleures conditions. Que vous
trouvez dans mon cœur toujours l’expression de mes sincères gratitudes.

A Mme. Michèle Violet-Asther, mes profondes pensées et remerciements pour sa disponibilité
à tout moment pour tout aide scientifique et pour sa contribution à mon travail de thèse, ainsi
que pour ses partages scientifiques et humaines qui me manqueront toujours.

A M. Alain de Caro, toutes mes pensées et mes remerciements pour sa présence et ses
conseils. Je tiens à exprimer aussi ma très vive reconnaissance envers Mme Carole Serveau-
Avesque, M. Robert Verger, M. Stéphane Canaan et M. Jean-François Cavalier, pour leur
présence perpétuelle, leurs discussions et leurs suggestions.

A Silvia Spinelli et Christian Cambillau pour leur accueil dans leur laboratoire Architecture
et Fonction des Macromolécules Biologique, pour leur assistance dans les expériences de
cristallogenèse et pour leur sympathie, merci.

A Mme Mireille Woudstra, merci pour sa sympathie et son amitié. Mes remerciements vont
aussi à Mr. André Zenatti pour toutes les réparations techniques urgentes qu’il nous faisait
et pour sa sympathie. A S. Robert, V. Point, M.-T. Ello, I. Poncin, M.-T. Sauve pour leur
disponibilité et leur aide. A Josiane de Caro et Francine Ferrato, qui malgré leurs départs à
la retraite nous visitent encore fréquemment au laboratoire et réjouissent notre séjour, merci
pour leur sympathie.

Mes salutations les plus chaleureuses à mes amis et collègues R. Dhouib, S. Amara, S.
Fernandez, C. Guerin, P. Capolino, N. Barou, V. Delorme, M. schue, J. Rodriguez et S.
Diomandé, pour leurs échanges et leur amitié qui ont rendu agréable le cadre de mon travail.
Un remerciement particulier à Ahmed Aloulou, pour son aide précieuse pendant ma
première année de thèse. Merci aussi à Aurélie Chabannes et Jean-Claude Bakala pour
avoir relu mon manuscrit de thèse.
Je tiens à mentionner le plaisir que j’ai eu à travailler au sein de l’EIPL, et j’en remercie tous
les membres.
Et enfin, ma profonde reconnaissance à ma famille, en espérant qu’ils bénissent toujours mes
pas dans ce monde.

LISTE DES ABREVIATIONS


3D Structure tridimensionnelle
ACS I/II Acyl-coA synthétase I/II
ADNr Acide désoxylribonucléique ribosomial
AC Acide citrique
ADC Acide dicarboxylique
AEP Protéase acide extracellulaire
AIC Acide isocitrique
AG Acides gras
AMOS Alcane cytochrome P450 monooxygénase
Aox Acyl-coA oxydase
AXP Protéase alcaline extracellulaire
AS Activité spécifique
ATP Adénosine triphosphate
CCK Cholecystokinine
-1
Cfu.g “Colony forming unit” par gramme
CoA Coenzyme A
CoPPLRP2 Lipase pancréatique apparentée de type II de
ragondin
CPG Chromatographie en phase gazeuse
CrL Lipase de Candida rugosa
DCO Demande chimique en oxygène
DG Diglycéride
FADH Fatty acid déshydrogénase
FALDH Fatty aldehyde déshydrogénase
FDA American food and drug administration
G+C Guanine + Cytosine
GLR Génolevures
GPLRP2 Lipase pancréatique apparentée de type II de
cobaye
GRAS Generally recognized as safe
HPL Lipase pancréatique humaine classique

HPLRP2 Lipase pancréatique apparentée de type II
humaine
Kb Kilo paires de bases
KG α-cétoglutarate
LB Lipid bodies (corps lipidiques)
Mb Mega paires de bases
MG Monoglycérides
MPD 2-méthyl-4,4-pentanediol
NADH Nicotinamide adénine dinucléotide
NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
PaL Lipase de Pseudomonas aeruginosa
PLA2 Phospholipase A2
RAL Lipase de Rhizopus arrhizus
SDSL – RPE Site directed spin labeling - spectroscopie de
résonnance paramagnétique
TG Triglycérides
TLL Lipase de Thermomyces lanuginosus
YLLIP2 Lipase LIP2p de Yarrowia lipolytica
YPD Yeast extract-Peptone-Dextrose
YPDO Yeast extract-Peptone-Dextrose-Huile d’olive
YPO Yeast extract-Peptone-Huile d’olive

TABLE DES MATIERES

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GENERALE ................................................................................................ 4
CHAPITRE 2 : YARROWIA LIPOLYTICA : UNE LEVURE NON-CONVENTIONNELLE ......................... 6
1. TAXONOMIE ................................................................................................................................................... 6
2. ECOLOGIE...................................................................................................................................................... 7
3. CARACTÉRISTIQUES GÉNOMIQUES ET PHYLOGÉNIE.................................................................................... 7
4. MÉTABOLISME DU CARBONE......................................................................................................................... 9
4.1. Métabolisme du glucose ......................................................................................................................... 9
4.2. Métabolisme des triglycérides et des acides gras ................................................................................ 11
4.3. Métabolisme des n-alcanes................................................................................................................... 12
5. MÉTABOLISME DE L’AZOTE ........................................................................................................................ 13
5.1. Protéolyse extracellulaire ..................................................................................................................... 13
5.1.1. La protéase alcaline extracellulaire (AEP).................................................................... 13
5.1.2. La protéase acide extracellulaire (AXP)........................................................................ 13
5.2. Métabolisme des acides aminés............................................................................................................ 14
5.3. L’ammoniac : molécule signal.............................................................................................................. 14
6. APPLICATIONS BIOTECHNOLOGIQUES DE YARROWIA LIPOLYTICA .......................................................... 16
6.1. Expression et sécrétion de protéines..................................................................................................... 16
6.2. Production de protéines et d’huiles d’organismes unicellulaires.......................................................... 16
6.3. Production de divers métabolites d’intérêt industriel ........................................................................... 17
6.3.1. Production de métabolites intermédiaires...................................................................... 17
6.3.2. Production d’acides dicarboxyliques (ADC) et d’acides gras ω-hydroxylés (AGH)..... 18
6.3.3. Production d’arômes...................................................................................................... 19
6.4. Applications en chimie fine.................................................................................................................. 19
6.5. Applications dans le domaine de la bioremédiation ............................................................................. 20
6.5.1. Bioremédiation des sols et des eaux contaminés par les hydrocarbures ....................... 20
6.5.2. Valorisation des déchets................................................................................................. 22
6.6. Applications dans l’industrie agroalimentaire ...................................................................................... 22
CHAPITRE 3 : YARROWIA LIPOLYTICA : UNE LEVURE OLEAGINEUSE....................................... 24
1. LES LIPIDES.................................................................................................................................................. 24
1.1. Définition.............................................................................................................................................. 24
1.2. Classification des lipides ...................................................................................................................... 24
1.2.1. Lipides apolaires............................................................................................................ 24
1.2.2. Lipides polaires.............................................................................................................. 24
Lipides de classe I .................................................................................................... 24
Lipides de classe II................................................................................................... 24
Lipides de classe III.................................................................................................. 25
1.3. Auto-organisation des lipides en présence d’eau.................................................................................. 25
1.3.1. Les films monomoléculaires ........................................................................................... 26
1.3.2. Les émulsions ................................................................................................................. 26
1.3.3. Les liposomes ................................................................................................................. 26
1.3.4. Les micelles .................................................................................................................... 27
1.3.5. Les cristaux liquides....................................................................................................... 28
2. ACCUMULATION DES LIPIDES CHEZ YARROWIA LIPOLYTICA ................................................................... 28
2.1. Interaction des cellules avec les substrats hydrophobes ...................................................................... 30
2.2. Mécanisme de transport des acides gras ............................................................................................... 31
2.3. Accumulation des lipides dans les corps lipidiques.............................................................................. 32
2.4. Régulation de l’accumulation des lipides dans les levures................................................................... 32
CHAPITRE 4 : YARROWIA LIPOLYTICA : UNE LEVURE LIPOLYTIQUE.............................................. 34
1. LES LIPASES ................................................................................................................................................. 34
1.1. Définition.............................................................................................................................................. 34
1.2. Spécificité des lipases vis-à vis des acylglycérols ................................................................................ 34
1

1.3. Caractéristiques cinétiques ................................................................................................................... 35
1.3.1. Phénomène cinétique d’activation interfaciale.............................................................. 35
1.3.2. Modèle cinétique interfacial........................................................................................... 38
1.4. Caractéristiques structurales ................................................................................................................. 39
1.4.1. Le repliement structural de type α/β hydrolase.............................................................. 40
1.4.2. La triade catalytique Ser…Asp/Glu …His et le mécanisme d’action proposé............... 41
Etape d’acylation...................................................................................................... 42
Etape de désacylation ............................................................................................... 43
1.4.3. La présence d’un volet amphiphile ................................................................................ 44
1.5. Etude des changements conformationnels des lipases.......................................................................... 45
1.5.1. Méthodes cristallographiques ........................................................................................ 46
Types de mouvement du volet ................................................................................. 46
Présence d’étapes intermédiaires de l’activation ..................................................... 47
Formes ouvertes de lipases obtenues en présence d’inhibiteurs .............................. 49
Formes ouvertes de lipases en absence d’inhibiteurs............................................... 52
1.5.2. Autres méthodes pour l’étude des changements conformationnels des lipases ............. 52
1.6. Effet du pH et de la température sur les lipases.................................................................................... 53
2. LES LIPASES MICROBIENNES ....................................................................................................................... 54
2.1. Généralités............................................................................................................................................ 54
2.2. Classification ........................................................................................................................................ 55
2.3. Localisation membranaire des lipases chez les levures ....................................................................... 56
2.4. Biotechnologie des lipases et applications............................................................................................ 58
2.4.1. Applications dans les détergents .................................................................................... 59
2.4.2. Applications en l’oléochimie.......................................................................................... 61
2.4.3. Applications dans l’industrie alimentaire ..................................................................... 61
2.4.5. Applications dans l’industrie laitière............................................................................. 62
2.4.6. Applications dans la production des monoglycérides.................................................... 63
2.4.7. Applications dans l’industrie du papier ......................................................................... 63
2.4.8. Applications en synthèse chimique................................................................................. 63
3. LE SYSTÈME LIPOLYTIQUE DE YARROWIA LIPOLYTICA ............................................................................ 64
3.1. Les différentes lipases identifiées chez Yarrowia lipolytica................................................................. 64
3.2. La lipase YLLIP2 (ou Lip2p) ............................................................................................................... 65
3.2.1. Séquence génomique et expression de la protéine ......................................................... 65
3.2.2. Caractérisation biochimique.......................................................................................... 67
3.2.3. Surproduction de la lipase YLLip2 par mutagénèse chimique ou génie génétique....... 68
3.2.4. Structure de la lipase YLLIP2 ........................................................................................ 69
3.3. Variabilité de la production de lipase en fonction de divers facteurs physiologiques .......................... 69
3.4. La biochimie de l’induction par l’oléate............................................................................................... 70
3.4.1. Induction de l’expression de gènes par les acides gras via les éléments de réponse
oléate (ORE)............................................................................................................................. 70
3.4.2. Induction de l’expression des gènes de lipase................................................................ 72
CHAPITRE 5 : RESULTATS - ETUDE QUANTITATIVE DE LA SECRETION DE LIPASE, DE LA
LIPOLYSE EXTRACELLULAIRE ET DU STOCKAGE DES LIPIDES CHEZ YARROWIA LIPOLYTICA
CULTIVEE EN PRESENCE D’HUILE D’OLIVE. ANALOGIES AVEC LA LIPOLYSE CHEZ L’HOMME
.............................................................................................................................................................................. 73
1. MATÉRIELS ET MÉTHODES.......................................................................................................................... 75
1.1. La souche utilisée ................................................................................................................................. 75
1.2. Les milieux de fermentation et les conditions de culture...................................................................... 75
1.3. Techniques analytiques......................................................................................................................... 76
1.3.1. Mesure de la croissance cellulaire................................................................................. 76
1.3.2. Mesure de l’activité lipolytique par potentiométrie ....................................................... 76
1.3.3. Extraction et analyse des lipides par TLC-FID ............................................................. 77
1.3.4. Analyse des esters méthyliques d’acides gras par chromatographie en phase gazeuse
(CPG) ....................................................................................................................................... 78
1.3.5. Analyse des protéines dans les cultures de levures........................................................ 79
2

1.4. Calculs .................................................................................................................................................. 80
1.4.1. Calcul de la quantité d’AG générée par la lipolyse et celle incorporée dans les cellules
.................................................................................................................................................. 80
2. RÉSULTATS .................................................................................................................................................. 80
2.1. Distribution de l’activité lipolytique entre les cellules et le milieu de culture...................................... 80
2.2. Production de lipase dans différentes conditions de culture................................................................. 85
2.3. La lipolyse de l’huile d’olive et l’absorption des lipides par Yarrowia lipolytica lors de la culture dans
les milieux YPO et YPDO........................................................................................................................... 88
2.4. Variations dans la composition en acides gras des TG et des AGL dans les cellules de Yarrowia
lipolytica...................................................................................................................................................... 93
3. DISCUSSION.................................................................................................................................................. 95
3.1. Choix des conditions de dosage optimales pour la mesure de l’activité lipolytique produite par
Yarrowia lipolytica...................................................................................................................................... 95
3.2. Contribution possible de différentes lipases à l’activité lipolytique totale mesurée dans les cultures de
Yarrowia lipolytica...................................................................................................................................... 96
3.3. Induction de la production de lipase et analogies avec la sécrétion des enzymes pancréatiques ........ 97
3.4. Lipolyse de l’huile d’olive par Yarrowia lipolytica et analogies avec la lipolyse gastrointestinale chez
l’homme....................................................................................................................................................... 97
3.5. Analogies entre la lipolyse extracellulaire par Yarrowia lipolytica et la lipolyse des lipoprotéines dans
le système vasculaire humain ...................................................................................................................... 99
3.6. Absorption des lipides et stockage par Yarrowia lipolytica ............................................................... 101
4. CONCLUSION.............................................................................................................................................. 103
CHAPITRE 6 : RESULTATS - PURIFICATION, INHIBITION ET CRISTALLOGENESE DE LA LIPASE
YLLIP2-WT EXPRIMEE CHEZ YARROWIA LIPOLYTICA, ET DE YLLIP2-WT, YLLIP2-NN ET YLLIP2-
N134Q EXPRIMEES CHEZ PICHIA PASTORIS. ......................................................................................... 104
1. MATÉRIELS ET MÉTHODES........................................................................................................................ 105
1.1. Purification des mutants de glycosylation .......................................................................................... 105
1.2. Inhibition de YLLIP2 et de ses mutants par le E ............................................................................ 106 600
1.3. Cristallogenèse ................................................................................................................................... 106
1.3.1. Méthode de la goutte assise.......................................................................................... 106
1.3.2. Méthode de la goutte suspendue .................................................................................. 107
2. RÉSULTATS ................................................................................................................................................ 107
2.1. Purification de YLLIP2 et de ses mutants .......................................................................................... 107
2.2. Inhibition d’YLLIP2 et de ses mutants par le E .............................................................................. 108 600
2.3. Cristallogenèse ................................................................................................................................... 112
2 .3.1. Criblage des conditions de nucléation ........................................................................ 112
2.3.2. Optimisation de conditions initiales pour cristalliser des monocristaux pour la collecte
de données de diffraction des rayons X.................................................................................. 113
3. DISCUSSION ET CONCLUSION.................................................................................................................... 114
3.1. Effet de la glycosylation sur la solubilité de la lipase et hétérogénéité de cette glycosylation dans les
deux systèmes d’expression Pichia pastoris et Yarrowia lipolytica.......................................................... 114
3.2. Choix de la protéine pour la cristallisation ........................................................................................ 115
PARTICIPATION A DES ETUDES ANNEXES : DOSAGE SPECIFIQUE DE LA CARBOXYL ESTER
HYDROLASE (CEH) AVEC LES ESTERS DE PEG COMME SUBSTRAT ................................................ 116
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................................................................... 132
3


Chapitre 1:
Introduction générale


Introduction générale

n grand nombre de microorganismes produisent des lipases extracellulaires, et
en particulier les levures oléagineuses (Hou, 1997; Hou and Johnston, 1992;
Rapp and Backhaus, 1992). La recherche sur les lipases microbiennes s’est U
développée dans les dernières années à cause de leur implication dans diverses
applications industrielles. Cependant, la production et la sécrétion de lipases, la lipolyse
extracellulaire, ainsi que les facteurs affectant ces phénomènes n’ont été étudiés que chez
certains microorganismes, et souvent avec des méthodes non-spécifiques.
Les études faites sur la physiologie de la production de lipases montrent que les mécanismes
de régulation de la biosynthèse de ces enzymes varient largement d’un microorganisme à
l’autre. Certaines levures produisent un mélange de lipases extracellulaires codées par des
gènes multiples. Les lipases secrétées présentent souvent une hétérogénéité dues à des
modifications post-traductionnelles comme la glycosylation.
La production de lipases par Calvatia gigantea (Christokopoulos et al., 1992), Rhizopus
oryzae (Salleh et al., 1993), Aspergillus niger (Pokorny et al., 1994) et Rhodotorula glutinis
(Papaparaskevas et al., 1992) est constitutive. Chez d’autres organismes comme Candida
rugosa (Dalmau et al., 2000), Geotrichium candidum (Shimada et al., 1992), et Yarrowia
lipolytica (Hadeball, 1991), les substrats lipidiques sont nécessaires pour la production de
lipase. Le glucose, par contre, présente souvent un effet inhibiteur sur la production de lipase
chez plusieurs microorganismes, sauf par exemple chez Pseudomonas sp, où il n’y a pas
d’effet de répression par le glucose sur la sécrétion de lipase (Chartrain et al., 1993), mais une
forte inhibition de la production de lipase par les acides gras à longues chaînes (Gilbert et al.,
1991). En présence de deux substrats, le glucose et les lipides, la levure consomme le glucose,
puis les lipides d’une façon séquentielle, comme cela a été observé chez R. oligosporus
(Nahas, 1988) et Geotrichum candidum (Shimada et al., 1992).

Dans ce contexte, mon travail de thèse s’est organisé autour de deux axes de recherche :
La caractérisation quantitative du système lipolytique chez Yarrowia lipolytica grâce à
la quantification de la lipolyse et de la sécrétion de lipase extracellulaire
simultanément et en présence de sources de carbone stimulatrice (huile d’olive) et/ou
répressive (glucose) de la sécrétion de lipase. Les levures sont les principaux
organismes unicellulaires eucaryotes utilisés comme modèles pour l’étude du
métabolisme humain. Elles présentent au niveau moléculaire une analogie avec les
cellules des mammifères. La lipolyse des triglycérides dans les levures a déjà été
4