La lecture en ligne est gratuite
Le téléchargement nécessite un accès à la bibliothèque YouScribe
Tout savoir sur nos offres
Télécharger Lire

Fluorescence spectroscopy of recoverin function and conformation [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Iris von der Hocht. Jülich Forschungszentrum

De
131 pages
Berichte des Forschungszentrums Jülich 4272 Fluorescence Spectroscopy of Recoverin Function and ConformationIris von der HochtBerichte des Forschungszentrums Jülich; 4272ISSN 0944-2952Institute of Neurosciences and Biophysics (INB)Cellular Signal Processing (INB-1) Jül-4272D 38 (Diss., Köln, Univ., 2008)Zu beziehen durch: Forschungszentrum Jülich GmbH · Zentralbibliothek, VerlagD-52425 Jülich · Bundesrepublik Deutschland 02461 61-5220 · Telefax: 02461 61-6103 · E-Mail: zb-publikation@fz-juelich.de Fluorescence Spectroscopy of Recoverin Function and Conformation Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch – Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Iris von der Hocht aus Köln Köln 2008 Berichterstatter: Prof. Dr. Jörg Enderlein Prof. Dr. Helmut W. Klein Prof. Dr. Markus Sauer Tag der letzten mündlichen Prüfung: 30. April 2008 Abstract Recoverin is a neuronal calcium sensor protein (NCS-protein) from the vertebrate photoreceptor which is involved in light adaptation. Recoverin changes its conformation upon sequential binding of two calcium ions.
Voir plus Voir moins

Berichte des Forschungszentrums Jülich 4272 Fluorescence Spectroscopy of Recoverin
Function and Conformation
Iris von der HochtBerichte des Forschungszentrums Jülich; 4272
ISSN 0944-2952
Institute of Neurosciences and Biophysics (INB)
Cellular Signal Processing (INB-1) Jül-4272
D 38 (Diss., Köln, Univ., 2008)
Zu beziehen durch: Forschungszentrum Jülich GmbH · Zentralbibliothek, Verlag
D-52425 Jülich · Bundesrepublik Deutschland
02461 61-5220 · Telefax: 02461 61-6103 · E-Mail: zb-publikation@fz-juelich.de


Fluorescence Spectroscopy of
Recoverin Function and Conformation








Inaugural – Dissertation


zur

Erlangung des Doktorgrades

der Mathematisch – Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Universität zu Köln






vorgelegt von

Iris von der Hocht

aus Köln








Köln 2008







































Berichterstatter:

Prof. Dr. Jörg Enderlein
Prof. Dr. Helmut W. Klein
Prof. Dr. Markus Sauer

Tag der letzten mündlichen Prüfung: 30. April 2008 Abstract

Recoverin is a neuronal calcium sensor protein (NCS-protein) from the
vertebrate photoreceptor which is involved in light adaptation. Recoverin changes
its conformation upon sequential binding of two calcium ions. This
conformational change induces the extrusion of a covalently attached myristoyl
residue from a hydrophobic binding pocket which enables Recoverin to interact
with lipid membranes (calcium-myristoyl switch).
In this thesis, I report on my investigation of Recoverin’s calcium
myristoyl switch, using a recently developed modification of fluorescence
correlation spectroscopy (FCS) that is called dual-focus FCS (2fFCS). This
method allows for measuring absolute diffusion coefficients with an accuracy of
better than a few percent. Recoverin, and the Recoverin mutants E85Q and E121Q
2+which bind only one or no Ca , respectively, were labeled with the fluorescent
dye Alexa647. Differences in the hydrodynamic radius due to conformational
changes of Recoverin and its mutants upon calcium binding were monitored by
measuring the diffusion coefficient of these molecules as a function of free
calcium concentration.
The calcium dependent interaction of Recoverin with lipid membranes
was measured in solutions of small unilamellar vesicles (SUVs) of different lipid
composition. Again, diffusion measurements were used to determine the fraction
of free and lipid-bound Recoverin using the strongly different diffusion
coefficients of both fractions. To account for the fluorescence brightness
difference of the dye label when in solution and close to a lipid membrane, a new
three-photon correlation analysis was developed and tested. Kurzzusammenfassung

Recoverin ist ein neuronales Kalzium Sensor Protein (NCS-Protein) aus
dem Photorezeptor der Wirbeltiere, das an der Lichtadaptation beteiligt ist.
Recoverin ändert seine Konformation durch die sequenzielle Bindung von zwei
Kalzium-Ionen. Diese Konformationsänderung induziert die Freisetzung eines
kovalent gebundenen Myristoylrestes aus einer hydrophoben Tasche des Proteins
und erlaubt Recoverin, an Lipidmembranen zu binden
(Kalzium-Myristoyl-Switch).
In dieser Arbeit beschreibe ich die Untersuchung des
Kalzium-Myristoyl-Switches von Recoverin mit einer vor kurzem entwickelten
Modifikation der Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS), der Zwei-Fokus
FCS (2fFCS). Mit dieser Methode können absolute Diffusionskoeffizienten mit
höchster Genauigkeit gemessen werden. Recoverin und die beiden
Recoverin-Mutanten E85Q und E121Q, die nur ein bzw. kein Kalzium-Ion binden
können, wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa647 markiert. Änderungen
des hydrodynamischen Radius von Recoverin, die durch kalziuminduzierte
Konformationsänderungen verursacht werden, können durch die Messung des
Diffusionskoeffizienten als Funktion der Kalziumkonzentration beobachtet
werden.
Die kalziumabhängige Wechselwirkung von Recoverin und
Lipidmembranen wurde mit Suspensionen kleiner, unilamellarer Vesikel (SUV)
unterschiedlicher Zusammensetzung untersucht. Auch hier wurde das
Diffusionsverhalten gemessen. Die sehr unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten
der beiden Fraktionen wurden benutzt, um den Anteil von freiem und
lipidgebundenem Recoverin zu bestimmen. Eine neue Drei-Photonen
Korrelationsanalyse, mit der die unterschiedlichen Fluoreszenzhelligkeiten der
Farbstoffmarkierung in Lösung und nahe der Membran berücksichtigt werden
können, wurde entwickelt und getestet.
Content


1 Introduction ...................................................................................................................... 1
1.1 Phototransduction ....................................................................................................... 1
1.2 A protein named Recoverin ........................................................................................ 4
1.3 Goals of this study ...................................................................................................... 9
2 Results and Discussion ................................................................................................... 11
2.1 A simple model membrane system - Supported Bilayers ........................................ 11
2.2 Getting away from the surface - Giant Unilamellar Vesicles .................................. 20
2.3 Measuring conformational changes with 2fFCS ...................................................... 30
2.4 Calcium induced shift in tryptophan fluorescence ................................................... 49
2.5 Binding of Recoverin to small lipid vesicles ........................................................... 62
3 Summary ......................................................................................................................... 79
3.1 Model membrane systems ........................................................................................ 79
3.2 Conformational changes of Recoverin investigated with 2fFCS ............................. 80
3.3 Interaction of Recoverin with small lipid vesicles ................................................... 80
4 Materials and Methods .................................................................................................. 83
4.1 Glass ......................................................................................................................... 83
4.2 Lipids ........................................................................................................................ 84
4.3 Small vesicles ........................................................................................................... 84
4.4 Building a supported bilayer .................................................................................... 85
4.5 Giant unilamellar vesicles (GUVs) .......................................................................... 86
4.6 Recoverin and its mutants ........................................................................................ 88
4.7 Labeling with fluorescent dyes ................................................................................ 88
4.8 Calcium buffer .......................................................................................................... 92
4.9 Tryptophan fluorescence measurements .................................................................. 94
4.10 Extraction of ROS-lipids .......................................................................................... 95
4.11 Two-focus fluorescence correlation spectroscopy (2fFCS) ..................................... 96
4.12 Imaging setup ......................................................................................................... 101
5 Acknowledgement ........................................................................................................ 103
6 Abbreviations ................................................................................................................ 105
7 References ..................................................................................................................... 107

Un pour Un
Permettre à tous d'accéder à la lecture
Pour chaque accès à la bibliothèque, YouScribe donne un accès à une personne dans le besoin