Giant vesicles - an ideal tool to study lateral phospholipid distribution and domain dependent protein membrane interactions [Elektronische Ressource] / von Martin Thomas Stöckl

Martin Stöckl

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 36
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 12 Mo

Extrait

Giant vesicles – An ideal tool to study lateral phospholipid
distribution and domain dependent protein membrane
interactions
D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biophysik
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Diplom-Biochemiker
Martin Thomas Stöckl
geb. 23.02.1980 in Ingolstadt
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön



Gutachter: 1. Prof. Dr. Andreas Herrmann
2. Prof. Dr. Thomas Pomorski
3. Prof. Dr. Daniel Huster

Tag der mündlichen Prüfung: 12.12.2008












































The most exciting phrase to hear in science,
the one that heralds the most discoveries,
is not "Eureka!" but "That's funny..."

Isaac Asimov Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Ansatz vorgestellt, um Lipiddomänen, die
Bindungsorte peripherer und integraler Membranproteine darstellen können, zu
charakterisieren. Insbesondere wurde die Analyse der Fluoreszenzlebenszeiten von NBD-
markierten Lipidanaloga benutzt, um Lipiddomänen in Giant unilamellar vesicles (GUV) und
darauf aufbauend, in der Plasmamembran von Säugerzellen zu untersuchen. Das typische
Zeitfenster von Fluoreszenzlebenszeiten im Bereich von Nanosekunden ermöglicht es, auch
sehr kurzlebige Lipiddomänen nachzuweisen.
Mit Hilfe des Fluorescence lifetime imaging (FLIM) wurden für die liquid disordered (ld) und
liquid ordered (lo) Domänen in GUV jeweils spezifische Werte für das Abklingen der
Fluoreszenz gemessen. Sogar die Existenz von submikroskopischen Domänen in GUV konnte
nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzlebenszeit des Lipidanalogs C6-NBD-PC zeigte in der
Plasmamembran von Säugerzellen eine breite Verteilung. Dies legt in Übereinstimmung mit
FLIM-Experimenten an aus der Plasmamembran von HeLa-Zellen gewonnenen Giant
vesicles nahe, dass in der Plasmamembran von Zellen eine Vielzahl verschiedener
submikroskopischer Lipiddomänen existiert.
Darauf aufbauend wurde die Fluoreszenzmikroskopie an GUV angewendet, um die Bindung
von fluoreszenzmarkiertem alpha-Synuclein an mittels FLIM charakterisierte Lipiddomänen
zu untersuchen. Die Experimente zeigten, dass das Protein mit hoher Affinität an negativ
geladene Phospholipide unter der Vorraussetzung bindet, dass diese sich in ld Domänen
befinden. Im Gegensatz dazu erfolgt keine Bindung wenn diese Lipide in lo Domänen
lokalisiert sind. Im Vergleich zum wildtypischen alpha-Synuclein zeigte die Variante A30P
eine geringere Affinität zur Membran, während die E46K-Variante eine stärkere Bindung
zeigte. Dies deutet darauf hin, dass bei den erblichen Formen des Morbus Parkinson eine
veränderte Assoziation des alpha-Synucleins mit der Membran eine Rolle spielen kann.

Schlagwörter:
GUV
FLIM
Mikroskopie
Lipiddomänen
Synuclein Abstract
In the present study a novel approach to characterize lipid domains, which may provide
binding sites for peripheral or integral membrane proteins, is demonstrated. In particular,
analysis of fluorescence lifetimes of NBD-labeled lipid analogues was used to study lipid
domains in Giant unilamellar vesicles (GUV) and – based on the GUV results – in the plasma
membrane of mammalian cells. As fluorescence decays in a few nanoseconds it is possible to
to detect also very short-lived lipid domains.
Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) revealed that the fluorescence decay of NBD-lipid
analogues showed domain dependent decay times in the liquid disordered (ld) and the liquid
ordered (lo) phase of GUV. Even the existence of submicroscopic domains in lipid
membranes could be detected by FLIM. A broad distribution of the fluorescence lifetime was
found for C6-NBD-PC inserted in the plasma membrane of mammalian cells. In agreement
with FLIM studies on lipid domain forming Giant vesicles derived from the plasma
membrane of HeLa-cells this may suggest that a variety of submicroscopic lipid domains
exists in the plasma membrane of intact mammalian cells.
Based on that, fluorescence microscopy was used on GUV to study the binding of
fluorescently labeled alpha-synuclein at lipid domains previously characterized by FLIM. The
experiments suggested that alpha-synuclein binds with high affinity to negatively charged
phospholipids, when they are embedded in a ld as opposed to a lo environment. When
compared with wildtype alpha-synuclein, the disease-causing alpha-synuclein variant A30P
bound less efficiently to anionic phospholipids, while the variant E46K showed enhanced
binding. This suggests that an altered association of alpha-synuclein with membranes may
play a role in the inherited forms of Parkinson’s disease.

Keywords:
Giant unilamellar vesicles
fluorescence lifetime imaging
microscopy
lipid domain
synuclein Abbreviations
aa amino acid
APS Ammonium persulfate
C- Carboxy-
C -NBD- 1-Palmitoyl-2-[6-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl]-sn-Glycero-3- 6
Chol cholesterol
Cm Chloramphenicol
DMSO Dimethylsulfoxide
dNTPs Desoxyribonucleotides
DTT Dithiothreitol
FBS fetal bovine serum
FLIM Fluorescence lifetime imaging microscopy
GF gelfiltration
GPMV Giant plasma membrane vesicles
GUV Giant unilamellar vesicles
Hepes 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
IEX ion exchange chromatography
IgG Immunoglobulin G
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
Kan Kanamycin
ld liquid disordered
lo liquid ordered
N- Amino-
NBD- 6-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino-
o.n. over night
PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis
PBS phosphate buffered saline
PI(4,5)P Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 2
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PSM N-palmitoyl-D-sphingomyelin
RT room temperature
SDS Sodium dodecylsulfate
SEM standard error of the mean
SSM N-stearoyl-D-sphingomyelin
TEMED N,N,N',N'-tetramethyl-ethane-1,2-diamine
TMR Tetramethyl-6-rhodamine
Tris 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol
TRITC Tetramethylrhodamine-isothiocyanate
WT wildtype

Glycerolipids were abbreviated using the following scheme:
DO Di-oleoyl- PC phosphatidylcholine
DP Di-palmitoyl- PS phosphatidylserine
DS Di-stearoyl- PA phosphatidylglycerol
PO Palmitoyl-oleoyl- PG phosphatidic acid

Amino acid exchanges were abbreviated using the following scheme: OXXZ
O amino acid in the wildtype protein
XX position of amino acid
Z introduced amino acid
Amino acids were abbreviated according to the common one-letter code. Table of content
Zusammenfassung--------------------------------------------------------------------------------------III
Abstract--------------------------------------------------------------------------------------------------- IV
Abbreviations--------------------------------------------------------------------------------------------- V
1 Introduction -----------------------------------------------------------------------------------1
1.1 The plasma membrane------------------------------------------------------------------------------1
1.2 Model membrane systems--------------------------------------------------------------------------6
1.3 Lateral lipid segregation----------------------------------------------------------------------------9
1.4 α-Synuclein and Parkinson’s disease----------------------------------------------------------- 14
1.4.1 Parkinson’s disease--------------------------------------------------------------------------------------------- 14
1.4.2 Origin of the Parkinson’s disease ---------------------------------------------------------------------------- 15
1.4.3 α-Synuclein------------------------------------------------------------------------------------------------------ 17
1.4.4 The link between α-synuclein and Parkinson’s disease -------------------------------------------------- 21
2 Aim of the study ---------------------------------------------------------------------------- 25
3 Material and Methods--------------------------------------------------------------------- 26
3.1 Material---------------------------------------------------------------------------------------------- 26
3.1.1 Chemical Material---------------------------------------------------------------------------------------------- 26
3.1.2 Biological Material--------------------------------------------------------------------------------------------- 26
3.1.2.1 E. coli strains -------------------------------------------------------------------------------------------- 26
3.1.2.2 Plasmids ------------------------------