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Hétérérogénéité génétique de la polyglobulie

De
172 pages
Sous la direction de Henri Wajcman
Thèse soutenue le 17 décembre 2008: Paris Est
La polyglobulie (PG) a un arrière plan clinique et physiopathologique varié, et dont la connaissance a beaucoup évolué depuis 5 ans. Elle a pour caractéristique nécessaire et commune une augmentation du volume globulaire total qui peut résulter de mécanismes moléculaires différents. L'érythrocytose est une forme de la PG ou` seule la lignée érythroïde semble être augmentée. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la mutation JAK2 (Val617Phe) et aux gènes EPOR, VHL, PHD2 chez des patients présentant une érythrocytose d'origine inconnue (98 familles). Nous avons trouvé 3 nouvelles mutations délétionnelles et d'autres mutations faux-sens et silencieuses sur EPOR. Les cellules FDCP-1 et 32D transfectées, qui expriment les récepteurs tronqués ont montré une hypersensibilité à l'Epo à concentration basse. Les analyses Epo-dose-réponse pour une mutation faux-sens étaient semblables à celles du type sauvage. La mutation JAK2(Val617Phe) était présente avec une faible fréquence dans la série de patients étudiés. La recherche des mutations dans le gène PHD2 nous a permis de trouver 3 nouvelles mutations frame-shift et non-sens, les seules connues à ce jour: Elles entraînent la perte d'une partie ou de l’ensemble du site catalytique de PHD2 dans l’hypothèse où elles seraient synthétisées. Ainsi, ces mutations et les deux autres mutations faux-sens décrites démontrent l'importance de PHD2 dans la régulation de la voie de HIF-a, et qu'une perturbation de cette régulation pourrait conduire à une PG. La majorité des patients reste sans défaut moléculaire identifié, et des recherches complémentaires sont nécessaires. Nous avons également étudié deux Hbs augmentant l'affinité pour l'oxygène: les Hbs Nantes et La Coruña. Enfin, nous avons cherché des mutations dans les 3 exons de DPGM chez 4 patients avec un taux de 2,3-DPG bas. Une seule mutation a été trouvée dans la région 5`, dans l'exon 1 non traduit, elle nécessite des études complémentaires.
-Polyglobulie
-Erythrocytose
-EpoR
-VHL
-PHD2
-HIF
Polycythemia has a varied clinical and physiopathological background, of which our knowledge has greatly evaluated since 5 years. It is characterised by augmentation of the red cell mass which can be resulted from different molecular mechanisms. Erythrocytosis is a form of polycythemia where only the erythrocytes are augmented. In this context, we looked for the mutation JAK2 (Val617Phe), and other mutations in the genes of EPOR, VHL, PHD2 in a series of patients with erythrocytosis of unknown origin (98 families). We found 3 new frame-shift mutations and other missense and silent mutations in the EPOR. Transfected FDCP-1 and 32D cell lines expressing a truncated EpoR showed increased sensitivity at low concentration of Epo. However, in the case of a missense EPOR mutation, the Epo-dose response assays were similar to that of the wild type. The mutation JAK2 (Val617Phe) was found at a low frequency in the studied patients. Looking for mutations in the PHD2 gene allowed us to find 3 new frame-shift and nonsense mutations, the only reported to date. The encoded PHD2, if synthesized, would lose its active site or a part of it. These mutations with the other two missense mutations reported provide the evidence of the importance of PHD2 in the regulation of HIF-a pathway, and that disturbing the oxygen-sensing pathway might be a cause of polycythemia. The molecular basis of polycythemia in the majority of patients is still to be identified, and complementary studies are necessary. We studied then two examples of Hbs with a high oxygen affinity: Hb Nantes et La Coruña. Finally, we looked for mutations in the 3 exons of DPGM in a series of 4 patients. One mutation in exon 1 in the 5`region was found, and needs further studies.
-Polycythemia
-Erythrocytosis
-EpoR
-VHL
-PHD2
-HIF
Source: http://www.theses.fr/2008PEST0028/document
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UNIVERSITE PARIS 12-VAL DE MARNE
UFR de SCIENCES
Ecole Doctorale 402-Sciences de la Vie et Santé
Thèse de doctorat de Génétique Cellulaire et Moléculaire
de l’Université Paris 12 Val de Marne
Champ disciplinaire : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Maha AL-SHEIKH
HETEROGENEITE GENETIQUE DE LA POLYGLOBULIE
Thèse dirigée par Monsieur Henri Wajcman
Soutenue le 17 Décembre 2008
JURY
Monsieur Henri WAJCMAN Directeur de thèse
Madame Nicole CASADEVALL Rapporteur
Monsieur William VAINCHENKER Rapporteur
Madame Valérie UGO Examinateur
Monsieur Frédéric GALACTEROS Examinateur
Monsieur Michel GOOSSENS Examinateur












À mes parents

À mon époux Monzer

À mes filles Nour, et Dima

À mes frères et mes sœurs

À ma belle-famille Ce travail a été réalisé dans l'équipe 11 de l’unité 955 « ex-unité 841» de l’inserm, et
dans le service de Biochimie et Génétique de l'hôpital Henri Mondor.


Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Michel GOOSSENS pour m’avoir accueilli
dans son service et au sein de son équipe. Je veux lui exprimer toute ma
reconnaissance pour la confiance qu'il m'a accordée et pour ses précieux conseils. Je
le remercie également d'avoir accepté juger ce travail.

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Monsieur le Docteur Claude
PREHU. C'est grâce à lui que je me suis lancée dans le projet de la polyglobulie. Je le
remercie pour ses idées, et ses compétences scientifiques et techniques, sans lesquels
cette thèse n'aurait pu aboutir.

Je témoigne toute ma gratitude à Monsieur le Docteur Henri WAJCMAN, mon
directeur de thèse, pour son encadrement, ses compétences scientifiques, son aide et
sa disponibilité. De plus, les conseils qu’il m’a donnés tout au long de la rédaction,
ont toujours été clairs, me facilitant grandement la tâche et me permettant d’aboutir à
la production de cette thèse.

Je remercie tout particulièrement Monsieur le Professeur Frédéric GALACTROS pour
les discussions scientifiques. Ses commentaires et ses suggestions ont été toujours
fort appréciés, et ses remarques ont été particulièrement enrichissantes. Je lui
remercie également d'avoir accepté de juger ce travail.

Je tiens également à adresser mes plus vifs remerciements à Madame le Professeur
Nicole CASADEVALL pour l'honneur qu'elle me fait en acceptant d'évaluer ce travail
et d'en être un rapporteur.

Je veux adresser tous mes remerciements à Monsieur le Docteur William
VAINCHENKER qui m'a accueilli au sein de son Unité de recherche à l'Institut
Gustave Roussy pour réaliser les études fonctionnelles des mutants du récepteur à
l'Epo. Je tiens à lui exprimer mes profonds remerciements de m’avoir fait l’honneur
d’accepter d’être un rapporteur de ma thèse.

Les remarques et les observations que mes deux rapporteurs m'ont émises ont
amélioré la qualité de cette thèse. Je les en remercie profondément.

Je remercie chaleureusement Madame le Docteur Valérie UGO pour son aide pour la
production de mon premier article, et pour l'intérêt qu’elle a bien voulu me porter en
acceptant participer à mon jury de thèse.

Mes remerciements vont également à Monsieur le Docteur Stéphane GIRAUDIER
pour son aide durant mon stage à l'institut Gustave Roussy.

Un grand merci à mon collègue le Docteur Kamran MORADKHANI pour son aide, sa
disponibilité, et pour les discussions que nous nous avons eues. Je lui souhaite
beaucoup de bien.

Je remercie aussi tous les stagiaires qui sont passés dans notre service, et avec qui j'ai
partagé des bons moments: Pierre, Ikbal, Fathia, Marc, Alicia, Maude et Laurent.
Merci à l'équipe du séquençage, et tout spécialement à Natacha MARTIN pour sa
gentillesse, et sa disponibilité.

Merci à tous les membres de l'équipe et du service de Biochimie et Génétique à
l'hôpital Henri Mondor.

Merci également à Carole TONETTI pour son aide à réaliser la partie expérimentale
de la mutagénèse dirigée. Merci à tous les membres du service d'hématologie pour
l’ambiance chaleureuse de travail.

Je souhaite enfin remercier nos amis, la Famille de Docteur IBRAHIM, pour leur
soutien pendant ces dernières années, et je leur exprime ma profonde sympathie.





















































La polyglobulie (PG) a un arrière plan clinique et physiopathologique varié, et dont la
connaissance a beaucoup évolué depuis 5 ans. Elle a pour caractéristique nécessaire et commune une
augmentation du volume globulaire total qui peut résulter de mécanismes moléculaires différents.
L'érythrocytose est une forme de la PG ou` seule la lignée érythroïde semble être augmentée.
Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la mutation JAK2 (Val617Phe) et aux gènes EPOR,
VHL, PHD2 chez des patients présentant une érythrocytose d'origine inconnue (98 familles).
Nous avons trouvé 3 nouvelles mutations délétionnelles et d'autres mutations faux-sens et
silencieuses sur EPOR. Les cellules FDCP-1 et 32D transfectées, qui expriment les récepteurs
tronqués ont montré une hypersensibilité à l'Epo à concentration basse. Les analyses Epo-dose-réponse
pour une mutation faux-sens étaient semblables à celles du type sauvage.
La mutation JAK2(Val617Phe) était présente avec une faible fréquence dans la série de
patients étudiés.
La recherche des mutations dans le gène PHD2 nous a permis de trouver 3 nouvelles
mutations frame-shift et non-sens, les seules connues à ce jour: Elles entraînent la perte d'une partie ou
de l’ensemble du site catalytique de PHD2 dans l’hypothèse où elles seraient synthétisées. Ainsi, ces
mutations et les deux autres mutations faux-sens décrites démontrent l'importance de PHD2 dans la
régulation de la voie de HIF-α, et qu'une perturbation de cette régulation pourrait conduire à une PG.
La majorité des patients reste sans défaut moléculaire identifié, et des recherches
complémentaires sont nécessaires.
Nous avons également étudié deux Hbs augmentant l'affinité pour l'oxygène: les Hbs Nantes et
La Coruña. Enfin, nous avons cherché des mutations dans les 3 exons de DPGM chez 4 patients avec
un taux de 2,3-DPG bas. Une seule mutation a été trouvée dans la région 5`, dans l'exon 1 non traduit,
elle nécessite des études complémentaires.
Polyglobulie, Erythrocytose, EpoR, VHL, PHD2, HIF.
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Polycythemia has a varied clinical and physiopathological background, of which our
knowledge has greatly evaluated since 5 years. It is characterised by augmentation of the red
cell mass which can be resulted from different molecular mechanisms.
Erythrocytosis is a form of polycythemia where only the erythrocytes are augmented.
In this context, we looked for the mutation JAK2 (Val617Phe), and other mutations in the
genes of EPOR, VHL, PHD2 in a series of patients with erythrocytosis of unknown origin (98
families).
We found 3 new frame-shift mutations and other missense and silent mutations in the
EPOR. Transfected FDCP-1 and 32D cell lines expressing a truncated EpoR showed
increased sensitivity at low concentration of Epo. However, in the case of a missense EPOR
mutation, the Epo-dose response assays were similar to that of the wild type.
The mutation JAK2 (Val617Phe) was found at a low frequency in the studied patients.
Looking for mutations in the PHD2 gene allowed us to find 3 new frame-shift and
nonsense mutations, the only reported to date. The encoded PHD2, if synthesized, would lose
its active site or a part of it. These mutations with the other two missense mutations reported
provide the evidence of the importance of PHD2 in the regulation of HIF-α pathway, and that
disturbing the oxygen-sensing pathway might be a cause of polycythemia.
The molecular basis of polycythemia in the majority of patients is still to be identified,
and complementary studies are necessary.
We studied then two examples of Hbs with a high oxygen affinity: Hb Nantes et La
Coruña. Finally, we looked for mutations in the 3 exons of DPGM in a series of 4 patients.
One mutation in exon 1 in the 5`region was found, and needs further studies.

Polycythemia, Erythrocytosis, EpoR, VHL, PHD2, HIF.
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......................................................................................................................................1
..................................................................................................................................3
................................................................................................................................6
1-Erythropoïèse: généralités....................................................................................................9
1-1 Régulation de l'érythropoïèse..................................................................................11
1-1-1 Ilots érythroblastiques..............................................................................11
1-1-2 Facteurs de transcription..........................................................................15
1-1-3 Facteurs de croissance.............................................................................17
1-2 L'Erythropoïétine, aspect historique.......................................................................17
1-2-1 Lieu de production...................................................................................17
1-2-2 Rôle fonctionnel.......................................................................................18
1-2-3 Régulation de la production d'Epo...........................................................18
1-3 Facteurs à action négative sur l’érythropoïèse........................................................20
2- Polyglobulies: vu d'ensemble.............................................................................................20
3 PG: Défauts dans les voies de signalisation induites par l'Epo........................................21
3-1 La maladie de Vaquez (PG primitive)................................................................21
3-1-1 Physiopathologie......................................................................................21
3-1-1-1 JAK2: le gène, la protéine........................................................24
3-1-2 Critères de diagnostic...............................................................................25
3-2 Polyglobulie primaire familiale et congénitale (PFCP).....................................28
3-2-1 Récepteur à l'Epo.....................................................................................28
3-2-1-1 Structure du récepteur à l'Epo...................................................30
3-2-1-2 Expression du récepteur à l'Epo................................................31
3-2-1-3 Voies de la transmission du signal............................................35
3-2-1-3-1 Voie JAK-STAT........................................................35
3-2-1-3-2 La voie PI3-kinase.....................................................43
3-2-1-3-3 Voies MAP kinases...................................................49
3-2-1-3-4 Lyn: une autre kinase impliquée dans la
phosphorylation de l'EpoR.........................................................53
3-2-1-3-5 Lnk: un régulateur négatif de l'érythropoïèse............53
3 3-2-1-3-6 DYRK3 et DAPK2....................................................53
3-2-1-4 EpoR dégradation.....................................................................54
3-2-1-5 Le récepteur à l'Epo et le c-kit..................................................55
4- PG résultant des défauts dans le système régulant la réponse à l'hypoxie (Défauts
dans la production de l'Epo)..................................................................................................56
4-1 Le facteur induit par l’hypoxie, Hypoxia Inducible Factor-1: HIF-1.....................56
4-1-1 Régulation de HIF-1α..............................................................................59
4-2 Régulation de l'activité de hydroxylase et ses modulateurs....................................61
4-2-1 Multiple prolyl hydroxylases: leurs fonctions différentielles dans la
régulation de HIF......................................................................................................................63
4-2-2 Régulation de la transcription et de la stabilité des prolyl hydroxylases.63
4-3 Mutations associées à une PG dans le système régulant la réponse à l'hypoxie et la
production de l'Epo...................................................................................................................64
4-3-1 Mutations de VHL....................................................................................64
4-3-2 Mutations de PHD2.................................................................................68
4-3-3 Mutations de HIF-2α...............................................................................68
5- Hémoglobines anormale avec augmentation d'affinité pour l'oxygène.........................70
5-1 Rappel de structure et fonction de l'Hb...................................................................70
5-2 Les gènes de globines.............................................................................................72
5-3 Classification moléculaire des hémoglobines anormales augmentant l'affinité pour
l'oxygène...................................................................................................................................72
5-4 Diagnostic...............................................................................................................75
6- Déficit en 2,3- Diphosphoglycérate (2,3-DPG).................................................................75
6-1 Diphophoglycérate mutase (DPGM)......................................................................75
6-1-1 Variants de l'enzyme DPGM associées à une PG...................................76
6-2 Hyperactivité en Pyruvate kinase (PK M ou PK LR).............................................77