Identification et validation de nouveaux gènes candidats impliqués dans la régulation du développement du fruit de tomate

Nicolas Viron

Description

Sous la direction de Martine Lemaire-Chamley
Thèse soutenue le 17 décembre 2010: Bordeaux 1
La tomate (Solanum lycopersicum) est l’espèce modèle pour l’étude du développement des fruits charnus. Il a notamment été montré que la signalisation hormonale était un élément central d’un réseau complexe de régulations gouvernant ce processus. Le but de ce travail de thèse était de réaliser la validation fonctionnelle de nouveaux gènes candidats potentiellement impliqués dans la régulation du développement du fruit. Pour cela, le travail s’est découpé autour de trois axes : 1) la validation de l’utilisation de quatre promoteurs de tomate et d’un promoteur d’Arabidopsis thaliana dans des constructions permettant la surexpression ou le silencing de gènes dans le fruit de tomate, à des phases particulières de son développement ou dans des tissus spécifiques du fruit, 2) l’analyse fonctionnelle de gènes codant pour des protéines à F-Box chez la tomate et 3) l’analyse fonctionnelle du gène SlGEM1.Le premier axe de ce travail a porté sur la caractérisation des promoteurs des gènes de tomate IMA (INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY), TPRP (TOMATO PROLIN-RICH PROTEIN), PPC2 (PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE 2) et PG (POLYGALACTURONASE), ainsi que du promoteur du gène CRC (CRABS-CLAW) d’Arabidopsis thaliana. Des plantes transgéniques ont été générées permettant d’exprimer, sous le contrôle de ces différents promoteurs, le gène rapporteur GUS seul ou fusionné à la GFP (Green fluorescent protein) et à un signal d’adressage au noyau (NLS). L’étude de ces plantes a permis de mettre en évidence la spécificité spatio-temporelle de l’expression de ces différents promoteurs lors du développement du fruit. Dans le cas du promoteur LePPC2, la fusion transcriptionnelle avec la GFP et un signal NLS a permis de montrer une activité spécifique dans les cellules du péricarpe des fruits de tomate en phase d’expansion cellulaire. Cette partie du travail de thèse a validé l’utilisation de ces différents promoteurs pour de futures analyses fonctionnelles de gènes régulateurs du développement du fruit chez la tomate.Le deuxième axe de ce travail a porté sur l’identification de protéines à F-Box impliquées dans la régulation du développement du fruit chez la tomate. En effet, il a été montré que ces protéines à F-Box jouent un rôle particulièrement important dans les processus de régulation chez les plantes grâce à leur fonction de reconnaissance de protéines régulatrices cibles par les complexes SCF (SKP1-Cullin-F-Box), qui sont alors marquées par ubiquitinylation, pour leur dégradation par le protéasome 26S. Parmi les 95 séquences de protéines à F-Box disponibles dans les bases de données d’EST au début de ce travail, quatre gènes candidats ont été retenus pour leur expression tissu-spécifique lors du développement précoce du fruit. Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) ont été générées pour chacun de ces gènes candidats et leur analyse préliminaire a permis de proposer un rôle dans le développement chez la tomate pour une d’entre elles.Le troisième axe de ce travail a porté sur la caractérisation fonctionnelle du gène SlGEM1, l’orthologue du gène AtGEM (GLABRA2-EXPRESSION MODULATOR), dont le niveau d’expression semblait corrélé à la taille des cellules dans le fruit de tomate. En effet, les données disponibles sur AtGEM montrant son implication dans la coordination de la prolifération et la différenciation des cellules en faisaient un candidat intéressant au contrôle de la taille et du développement du fruit. Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) SlGEM1 ont été générées, et des mutants de ce gène ont été identifiés par TILLING dans la banque de mutants EMS de la variété Microtom de tomate disponible au laboratoire. Le phénotypage de ces plantes a permis de mettre en évidence une potentielle implication de SlGEM1 dans le développement des fleurs et dans la fertilité des grains de pollen.
-Solanum lycopersicum
-Tomate
-Fruit
-Développement
-F-Box
-Gem (glabra2-expression modulator)
-Promoteurs
Tomato (Solanum lycopersicum) is a model species for studying fleshy fruit development. It has been shown that hormone signaling plays a crucial role in the complex regulatory network governing this developmental process. The aim of this thesis was to perform the functional validation of new candidate genes potentially involved in the regulation of fruit development. For this, the work was divided into three parts: 1) validate the use of four tomato promoters and one promoter of Arabidopsis thaliana in recombinant vectors for the overexpression or silencing of genes in tomato fruit at particular phases of development or in specific fruit tissues, 2) functional analysis of genes encoding F-Box proteins in tomato and 3) functional analysis of SlGEM1 gene.The first part of this work has focused on the characterization of tomato promoters from IMA (INHIBITOR ACTIVITY OF MERISTEM), TPRP (TOMATO Proline-Rich Protein), PPC2 (PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE 2) and PG (polygalacturonase), as well as the promoter of Arabidopsis thaliana CRC gene (CRABS-CLAW). Transgenic plants were generated to express the GUS reporter gene alone or fused to GFP and a NLS signal for nucleus targeting, under the control of the different promoters. The study of these transgenic plants highlighted the specific spatio-temporal expression of these promoters during fruit development. In the case of LePPC2 promoter, the transcriptional fusion with NLS-GFP revealed a specific activity in the large cells of tomato fruit pericarp. This part of the thesis work validated the use of the five different promoters for future functional analysis of genes regulating fruit development in tomato.The second part of this work focused on the identification of F-Box proteins involved in the regulation of tomato fruit development. In plants, it has been shown that F-Box proteins play an important role in regulating processes, due to their specific interaction with regulatory proteins targeted by the SCF complex (SKP1-Cullin-F-Box), leading to their ubiquitination and degradation by the 26S proteasome. Among the 95 sequences of F-Box proteins available in tomato databases at the beginning of this work, four candidate genes were selected for their tissue-specific expression during tomato fruit early development. Transgenic plants (RNAi and over-expression) were generated for each of these candidate genes and their preliminary analysis allowed to propose a role in tomato vegetative development for one of them.The third part of this work focused on the functional characterization of SlGEM1, orthologous to AtGEM (GLABRA2-EXPRESSION MODULATOR). Indeed, a previous work revealed that the expression level of SlGEM1 was correlated with tomato fruit cell size. Available data on AtGEM showing its involvement in the coordination of cell proliferation and differentiation made it an attractive candidate to the control of fruit size and development. Transgenic plants (SlGEM1 RNAi and over-expression) were generated, and mutants of this gene were identified by TILLING in the Microtom mutant collection available in the laboratory. Phenotyping of these plants suggested the involvement of SlGEM1 in flower development and in the fertility of pollen grains.
-Solanum lycopersicum
-Tomato
-Fruit
-Development
-F-Box
-Gem (glabra2-expression modulator)
-Promoters
Source: http://www.theses.fr/2010BOR14209/document

Sujets

• Tomate
• Développement
• Promoteur
• Tomato

Informations

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• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

N° d’ordre : 4209






THÈSE

PRÉSENTÉE A

L ’ UNIV E RS I T É BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ

Par Nicolas VIRON

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : BIOLOGIE VÉGÉTALE

Identification et validation de nouveaux gènes candidats impliqués
dans la régulation du développement du fruit de tomate

Directeur de recherche : Mme M. LEMAIRE-CHAMLEY




Soutenue le 17 Décembre 2010

Devant la commission d’examen formée de :

M. BOUZAYEN, Mondher ENSAT Toulouse Professeur
M. TORREGROSA, Laurent SUPAGRO Montpellier Professeur
M. GRANELL, Antonio CSIC, Valencia Directeur de recherche
M. HERNOULD, Michel Université Bordeaux 2 Professeur
Mme LEMAIRE-CHAMLEY, Martine INRA Bordeaux Chargé de Recherche


Université Bordeaux 1
Les Sciences et les Technologies au service de l’Homme et de l’environnement
REMERCIEMENTS

Je tiens tout d’abord à remercier ma Directrice de thèse, Martine Lemaire-Chamley, pour la
qualité de son encadrement et la disponibilité (et la patience !) dont elle a fait preuve pendant
ces trois années. Ce manuscrit n’aurait pu être réalisé sans ses conseils et ses corrections.
Merci de ne pas t’être trop exaspérée face à mes blagues plus ou moins drôle, ni face à ma
conception particulière des plannings…
Je tiens aussi à remercier Christophe Rothan de m’avoir donné l’opportunité de réaliser ce
travail de thèse dans son équipe, et d’avoir supervisé mon travail ainsi que la rédaction de ce
manuscrit. Merci aussi à Dominique Rolin et Christian Chevalier de m’avoir accueilli au sein
de l’UMR Biologie du Fruit.
Je remercie également Messieurs Mondher Bouzayen, Laurent Torregrosa, Antonio Granell et
Michel Hernould d’avoir accepté d’évaluer mon travail en prenant part au jury de thèse.
Je remercie Adeline Moïse et l’équipe du Pôle d’Imagerie du Végétale du Bordeaux Imaging
Center pour la réalisation des observations microscopiques de mes différents transformants.
Merci aussi à Cécile Bres et aux différentes personnes de la plateforme TILLING du Centre
de Génomique Fonctionnelle de Bordeaux pour l’identification des mutants d’un de mes
gènes candidats.
Je souhaite également remercier Moftah Alhagdow qui a réalisé les différents transformants
de tomate utilisés pour la caractérisation des promoteurs fruits-spécifiques. Je le remercie de
m’avoir formé à la transformation génétique de cette plante.
Je remercie aussi les différentes personnes qui se sont succédé à la gestion de la serre et qui
ont veillé à la bonne santé de mes plantes : Patricia Ballias, Aurélie Honoré-Alexandre, Medhi
Miloudi et Isabelle Atienza. Merci également à Florence, Catherine et Nathalie pour le côté
administratif de cette thèse et à Jean-Pierre, Claudine, Alain et Laurent pour le côté matériel.
Merci également aux stagiaires qui ont activement participé aux travaux : Aurélie, Julie et
Imane.
Mes remerciements vont aussi à mes co-locataires de bureau passés Louise et Fabien, et
présents Lisa, Antoine et Joana pour les discussions pas toujours scientifiques mais ô combien
intéressantes qui ont rythmées les journées de manip. Désolé de vous avoir saoulé avec des
sujets qui visiblement n’intéressaient que moi…^^
Je remercie aussi les différents thésards avec qui j’ai pu échanger, et qui m’ont permis de
relativiser l’état d’avancement de mon travail : Medhi, Elodie, Guillaume, Julie, Matthieu
(avec 2 "t"!) Merci aussi à Mathieu (avec 1 "t" et 1 cocard…meuh non c’est pas violent le
rugby !) qui a eu la chance et l’immense privilège de stériliser des graines avec moi ! hé hé ! Merci à toutes les personnes de l’UMR 619 qui ont eu une oreille attentive pour mes
questions scientifiques, ou qui ont simplement été captivées par mes aventures hors-labo
(vous pourrez d’ailleurs retrouver tous mes conseils concernant le Code de la Consommation,
Free, ou encore l’amputation de la queue d’un chat dans mon autobiographie " Francis
LaPince, ma vie, mon oeuvre" !) Merci donc à Yo, Ninie, Benoit, Cécile, DJ, Ken, Pierrot le
Ninja, les Fred’s (Ben dis-donc, on vous voit plus aux soirées…), Jennifer, Véro, Carine,
Yves, Massimo, JP, Julien (A. et P.), Thomas, Bertrand, Marie-Hélène, Katia, Mickael, Linda,
Emeline, Philippe.
Je tiens également à remercier différentes personnes croisées tout au long de mon cursus
universitaire, et qui ont influencé mon orientation professionnelle : Malika Aïnouche, Fatma
et David Lecourieux, et Valérie Schurdi-Levraud.
Je remercie enfin ma famille, et tout particulièrement mes parents qui m’ont soutenu pendant
toutes ces années de fac, sans (trop) montrer leur inquiétude face à un cursus aussi long.
Merci enfin et surtout à Stef pour ton soutien et ton affection, si je suis allé au bout de ce
projet c’est en grande partie grâce à toi !

Bon bah voilà…ça c’est fait ! ^^


ABREVIATIONS

Acides nucléiques et nucléotides
ADN Acide désoxyribonucléique
ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire
ATP Adénosine 5’ triphosphate
ARN Acide ribonucléique
dNTP Désoxynucléotide 5’ triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
EST Marqueur de séquence exprimé (« Expressed Sequence Tag »)

Unités
°C Degré Celsius
g Accélération
kDa KiloDalton
pb, kb, kpb, Paire de bases, kilobases, kilopaire de bases
U Unité
rpm Rotation par minute
s, min, h Seconde, minute, heure

Divers
ABA Acide abscissique
AIA Acide 3-indole acétique
CTAB Bromure d'hexadécyltriméthylammonium
DAPI 4’,6-diamino-2-phénylindole
DEPC Diéthylpyrocarbonate
DNAse Désoxyribonucléase
DO Densité optique
DTT Dithiothréitol
EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique
EMS Méthyl sulfonate d’éthyl (“Ethyl methyl sulfonate”)
GFP « Green fluorescent protein »
JAA Jours après anthèse (DPA, « days post anthesis »)
LB, RB Bordures gauche et droite du T-DNA (« Left border, right border »)
mQ MilliQ
ORF Cadre ouvert de lecture (« Open reading frame »)
p/p, p/v, v/v poids/poids, poids/volume, volume/volume
PCR Réaction de polymérisation en chaine (« Polymerase chain reaction »)
qPCR PCR quantitative en temps réel
QTL Ttrait de caractère quantitatif (« Quantitative Trait Loci »)
RNAse Ribonucléase
RNasin Inhibiteur de ribonucléase (“Ribonuclease inhibitor”)
RT-PCR Transcription inverse suivie d’une PCR
SDS Sodium dodécyl sulphate
Tris Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane
UV Ultraviolet

Sommaire
Chapitre 1 : INTRODUCTION ........................................................................................................ 1
I. La Tomate............................................................. 1
I.A Histoire de la tomate ...... 1
I.B Intérêt scientifique ......................................................................................................... 2
I.C Importance agronomique et nutritionnelle ..... 5
I.C.1 La production ........... 5
I.C.2 Importance nutritionnelle ........................................................................................ 7
II. Structure et développement du fruit de tomate .................................. 8
II.A De la graine au fruit ....................................................................... 8
II.B Structure du fruit de tomate ........................ 10
II.C Développement du fruit de tomate .............................................. 11
II.C.1 La mise à fruit ....................................................................... 12
II.C.2 La phase de division cellulaire ............... 12
II.C.3. La phase d’expansion cellulaire ............................................ 13
II.C.4. La mûrissement du fruit ....................................................... 14
III. Régulation du développement précoce du fruit ................................................................ 16
III.A La famille des gènes à MADS-Box ................................................ 17
III.B Contrôle de la taille et de la forme du fruit de tomate................. 18
III.B.1 Fw2.2 (Fruit weight 2.2) ......................................