Impact d'un inhibiteur de protéases à sérine, le TFPI-2, sur le microenvironnement tumoral pulmonaire, Impact of a serine proteinase inhibitor expression, TFPI-2 (Tissue Factor Pathway Inhibtor-2 on the tumoral pulmonary microenvironment

Guillaume Gaud

Description

Sous la direction de Pascale Reverdiau, Sophie Iochmann
Thèse soutenue le 11 février 2009: Tours
Le TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor 2 est un inhibiteur de la plasmine qui peut limiter la génération de métalloprotéases (MMP) et réduire ainsi le potentiel invasif des cellules tumorales, essentiel à la formation de métastases. Deux clones cellulaires inactivés pour le TFPI-2 par une stratégie d’ARN interférence ont été réalisés (miRNA-1b et -2b). Ces clones ont un pourcentage de migration et d’invasion 2 à 3 fois supérieur au clone contrôle, associé à une plus grande adhérence à la laminine et au collagène IV et à une augmentation de l’expression des MMP-1 et –3. En cocultures directes avec des fibroblastes pulmonaires sains, une augmentation des MMP-3, -7 et–13 a été observée avec les clones miRNA-1b et -2b. En présence des milieux conditionnés des ces clones, une potentialisation de la surexpression des MMP-1, -3, -7 a été observée. Cette étude nous a permis de démontrer que le TFPI-2 a un impact sur les gènes impliqués dans le remodelage de la MEC, notamment lors des interactions entre les cellules tumorales et les cellules stromales.
-Tfpi-2
TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor-2), an inhibitor of serine proteinases, particularly plasmin, can indirectly regulate the activation of MMPs, thus regulating ECM degradation and tumour cell invasion. Our results demonstrated that TFPI-2 silencing was associated with a 2 and 3-fold increase in invasive ability through basement membrane components, for clones NCI-H460 miRNA-1b and -2 respectively, associated with an increased in the relative attachment towards laminin and collagen IV and MMP-1 and MMP–3 overexpression. In direct coculture with fibroblasts, an increase in MMP-3, -7 and -13 transcriptional expression was observed when CCD19-Lu cells were cocultured with both miRNA-1b or -2b clones. In indirect coculture, allowing contact between fibroblasts and NCI-H460 clones conditioned media, an increase in MMP-1, -3 and -7 fibroblastic expression was measured. This study has demonstrated that TFPI-2 can influence ECM remodelling-associated genes and then act as a pericellular proteolysis inhibitor, particularly at the tumour-stroma interface.
Source: http://www.theses.fr/2009TOUR4007/document

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 54
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS


ÉCOLE DOCTORALE : Santé, Sciences, Technologies
INSERM U618 : Protéases et Vectorisation Pulmonaires
Equipe 3 : Aérosols et Cancer Bronchopulmonaire

THÈSE présentée par :
Guillaume GAUD

Soutenue le : 11 Février 2009


Pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université François - Rabelais
Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé


Impact de l’expression d’un inhibiteur de
protéases à sérine, le TFPI-2, sur le
microenvironnement tumoral pulmonaire


THÈSE dirigée par :
Mme Pascale Reverdiau Professeur, Université François Rabelais de Tours
Co-encadrement par :
Mlle Sophie Iochmann Maître de conférences, Université François Rabelais de Tours

RAPPORTEURS :
Mme Valérie Trichet Maître de conférences, Université de Nantes
Mr Vincent Lagente Professeur, Université de Rennes


JURY :
Mr Philipe Birembaut Professeur, Université de Reims
Mr Francis Gauthier Professeur, Université François Rabelais de Tours
Mlle Sophie Iochmann Maître de conférences, Université François Rabelais de Tours
Mr Vincent Lagente Professeur, Université de Rennes
Mme Pascale Reverdiau Professeur, Université François Rabelais de Tours
Mme Valérie Trichet Maître de conférences, Université de Nantes























2
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé au sein de l’unité INSERM U618 dirigée par le Professeur Francis
GAUTHIER et ce doctorat a pu être effectué grâce au soutien financier de la Région Centre.
J’exprime mes sincères remerciements au Professeur Yves Gruel pour m’avoir accueilli au
sein de son équipe

Je tiens à exprimer ma reconnaissance au Professeur Pascale REVERDIAU et au Docteur
Sophie IOCHMANN pour avoir encadré mes premiers pas dans la recherche. Votre rigueur,
votre curiosité scientifique et votre esprit critique m’ont beaucoup appris. Je tiens à vous
remercier tout particulièrement pour votre disponibilité lors de ces longs mois de rédaction où
vous avez été présentes à chaque étape pour me diriger dans cet exercice.

J’adresse mes plus sincères remerciements aux membres du jury :
- le Professeur Francis GAUTHIER qui m’a accueilli dans l’unité U618 et a accepté
de faire partie de mon jury,
- le Professeur Vincent LAGENTE et le Docteur Valérie TRICHET qui me font
l’honneur d’être les rapporteurs de ma thèse,
- le Professeur Philippe BIREMBAUT qui a accepté de juger cette thèse.

Merci à l’équipe d’enseignants en Biochimie qui m’a guidé lors de mes trois années de
monitorat : Les Professeurs Francis Gauthier et Fréderic ESNARD, Les Docteurs Fabien
LECAILLE, Michelle FERRER, Sylvie ATTUCCI et Lydie NADAL-DESEBARATS les
Docteurs Emanuel GODAT et Marina SHKRELI.

Merci aux étudiants de la promotion 2005-2008 : Kevin « Keuvin » BARANGER, l’homme
à qui il ne faut pas laisser une raquette entre les mains ; Alexandre « gromoute »
GAUTHIER, l’homme qui a inventé le poker ; et à Agnès « bouclettes » MAILLET, la
femme qui murmurait à l’oreille des souris nude. Merci également à Florian « flo »
VEILLARD, le seul homme au monde capable de manger son poids en saucisson.

Merci également à Nathalie HEUZE-VOURC’H pour ses conseils scientifiques et sa bonne
humeur perpétuelle. Par contre, je ne te remercie pas pour tes revers dévastateurs au squash...

Un grand merci au Docteur Benjamin BRILLET, à Stéphanie PETIOT et à Pierre
LAPAQUETTE pour leur participation à ce travail.
3
Merci aux « nouveaux » arrivants : Gwen, Clément, Annabelle, Noémie ; et à tous les
membres de l’unité 618.

Un immense merci à tous mes amis tourangeaux : Anne-Marie, Redot, Marina, Yo, Caro,
Flo, Julien, Greg, Amandine, Valérie ; et aux autres amis éparpillés dans le pays et de part
le monde : Aurelien, Romain, Clem, Aurelie, Zabou, Matthieu, Tonio, Martin, Yann,
Mad, oingh, Mat et les autres. Merci pour votre présence, votre humour et les vacances et
week-end passés ensemble.

Merci à Julien Fauvel, complice pendant toutes mes années universitaires et sans qui je n’en
serais peut être pas arrivé là.

Un grand merci à toute ma famille et particulièrement à mes parents, mon frère, Matthieu, et
ma belle sœur, Cécile. Votre patience et votre soutien inconditionnel ont été primordial dans
l’accomplissement de ce travail.

Un grand merci à Catherine et Jonathan TOWNER pour les bons moments passés
ensemble et ceux à venir.

Un remerciement particulier à Anne ETIENNE et Luis RODRIGUEZ, pour leur soutien et
leur chaleur.

Enfin mes derniers mots vont vers ma complice depuis tant d’années, Marianne. Tu es
certainement la plus méritante pour avoir réussi à me supporter quotidiennement pendant ces
trois années et particulièrement pendant ces derniers mois de rédaction. Une page se tourne et
nous en écrirons de nouvelles, ensemble, à l’étranger…
4
RESUME

La progression tumorale est un processus multi-étapes dépendant notamment des
interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma environnant. Le développement du
cancer broncho-pulmonaire, première cause de mortalité par cancer chez l'homme, implique
ainsi le dialogue entre les cellules tumorales et les cellules fibroblastiques, composant
cellulaire prépondérant du microenvironnement pulmonaire. Pour former ces métastases à
distance de la tumeur primitive, les cellules tumorales pulmonaires vont franchir de
nombreuses barrières cellulaires et matricielles, notamment grâce à la plasmine et à des
métalloprotéases (MMP). Le TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor 2), maintenant
considéré comme un gène suppresseur de tumeur, est un inhibiteur de la plasmine qui peut
limiter la génération de MMP et réduire ainsi le potentiel invasif des cellules tumorales. Le
laboratoire avait préalablement montré qu’une diminution de l’expression de cet inhibiteur de
protéases, associée à une hyperméthylation de son promoteur, était fréquemment observée
dans les stades les plus avancés de cancer broncho-pulmonaire. Cependant les conséquences
de cette répression transcriptionnelle du TFPI-2 dans le microenvironnement tumoral
pulmonaire restent encore mal connues.
Dans le but d’étudier ces mécanismes, une stratégie d’ARN interférence basée sur des
micro RNA (miRNA) a été développée afin d’inactiver stablement et de façon spécifique le
TFPI-2. Deux clones cellulaires pour lesquels l’inactivation du transcrit du TFPI-2 était
supérieure à 90% ont été sélectionnés (miRNA-1b et –2b). Avec les clones cellulaires
miRNA-1b et -2b, un pourcentage de migration et d’invasion 2 à 3 fois supérieur a été
observé par rapport au clone miRNA-Nég. Ces résultats sont associés à une plus grande
adhérence des cellules aux différentes protéines de la matrice extracellulaire et notamment à
la laminine et au collagène IV et à une augmentation de l’expression des MMP-1 et –3.
Deux modèles de coculture, mettant en jeu des fibroblastes pulmonaires sains (CCD-
19-Lu) et les clones de cellules tumorales inactivées pour le TFPI-2 ont été développés. Ainsi
en cocultures directes qui impliquent des contacts entre les deux types cellulaires et
permettent l’étude de signaux membranaires, une augmentation des MMP-3, -7 et–13 a été
observée avec les cellules tumorales inactivées pour le TFPI-2. En présence de milieux
conditionnés, sources de formes protéiques solubles produites par les cellules tumorales, une
potentialisation de l’expression transcriptionnelle et protéique des MMP-1, -3, -7 a également
été montrée lorsque l’expression du TFPI-2 par les cellules tumorales a été inhibée.
Cette étude nous a permis de démontrer que le TFPI-2 a un impact sur les gènes
impliqués dans le remodelage de la MEC et pourrait jouer un rôle inhibiteur de la protéolyse
péricellulaire notamment lors des interactions entre les cellules tumorales et les cellules
stromales.

Mots clés : cancer, microenvironnement, TFPI-2, MMP, ARN interférence, miRNA