Impact d'une contamination au méthylmercure par voie alimentaire sur l'expression génétique, la bioénergétique, et la reproduction chez le poisson zèbre Danio rerio

Sébastien Cambier

Description

Sous la direction de Patrice Gonzalez, Jean-Paul Bourdineaud
Thèse soutenue le 15 décembre 2009: Bordeaux 1
Les effets de la contamination au méthylmercure chez le poisson zèbre Danio rerio ont été interrogés au sein de deux tissus, le muscle squelettique et le système nerveux central, dont le choix fut motivé par leur fort potentiel bioaccumulateur de cet organométallique. Après contamination par voie trophique, à un niveau d’exposition représentatif de ce qui peut advenir dans certains écosystèmes aquatiques, nos observations expérimentales indiquent que ce métal perturbe fortement le métabolisme mitochondrial dans les muscles, mais épargne celui du cerveau ; en outre, l’analyse de l’expression génique suggère une perturbation de l’homéostasie du calcium dans ces deux tissus. Dans le système nerveux central, parmi les synapses glutamatergique et GABAnergique, seule la voie métabolique du GABA semble montrer une adaptation face au MeHg. Concernant le muscle squelettique, l’analyse SAGE a permis d’appréhender les impacts du MeHg à l’échelle cellulaire, révélant également une perturbation de la synthèse protéique, l’induction d’un stress au niveau du reticulum endoplasmique ainsi que l’induction de plusieurs gènes impliqués dans les processus de détoxication et les voies de réponse générale au stress. Notre étude a également mis en évidence la surexpression du gène de la vitellogénine dans le muscle chez des poissons mâles désignant ainsi ce métal comme un perturbateur endocrinien. Enfin, nous avons également révélé une perturbation importante de l’éclosion des œufs associée à un transfert maternel de ce toxique.
-Méthylmercure
-Reproduction
-Danio rerio
-Génotoxicité
-Muscle
-Bioénergétique
-Cerveau
-SAGE
The effects of methylmercury contamination on the zebrafish, Danio rerio, were assessed in two tissues, the skeletal muscle and the central nervous system, whose choice was motivated by their high potential to bioaccumulate this organometallic. After contamination by dietary, at a representative exposure level of which may arise in some aquatic ecosystems, our experimental observations indicate that metal strongly disrupts the mitochondrial metabolism in the muscles, but savings that the brain; in addition, the gene expression analysis suggests a disruption of the calcium homeostasis in these two tissues. In the central nervous system among glutamatergique and GABAnergique synapses, only the metabolic pathway of the GABA seems to show an adaptation to the MeHg. Concerning the skeletal muscle scanning SAGE analysis helped to understand the impacts of the MeHg at the cellular scale. It is also revealing a disruption of the protein synthesis, the induction of a stress at the endoplasmic reticulum level as well as the induction of several genes involved in detoxification process and general stress response. Our study has also highlighted the induction of the vitellogenin gene in the muscle of male fish designating this metal as an endocrine disruptor. Finally, we have also revealed a significant disruption of hatching eggs associated with maternal transfer of this toxic.
-Methylmercury
-Danio rerio
-Breeding
-Genotoxicity
-Bioenergetic
-SAGE
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13954/document

Sujets

• Méthylmercure
• Poisson zèbre
• Génotoxique
• Bioénergétique
• Cerveau
• SAGE

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 71
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

THESE
PRESENTEE A
L‟UNIVERSITE DE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE
« Sciences du Vivant, Géosciences et Sciences de l‟environne ment»

par Sébastien Cambier
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR
SPECIALITE : Ecotoxicologie

Impact d‟une contamination au méthylmercure par voie alimentaire sur
l‟expression génétique, la bioénergétique, et la reproduction chez le poisson
zèbre Dan io rerio.

Thèse soutenue le 15 décembre 2009
Devant le jury composé de :
M. F. Leboulenger Professeur, Université du Havre Rapporteur
M. P. Bustamante Professeur, Université de la Rochelle Rapporteur
M. J. Cachot Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur
M. D. Brèthes CR CNRS, HDR Examinateur
M. P. Gonzalez CR CNRS, HDR Directeur de Thèse
M. J.P. Bourdineaud Professeur, Université Bordeaux 1 Directeur de Thèse



Remerciements

Je tiens à remercier le professeur Jean-Charles Massabuau pour m‟avoir accueilli au
sein de l‟équipe GEMA mais aussi pour ses astuces et les systèmes D très pratiques en
expérimentation.
Je remercie le professeur Jean-Paul Bourdineaud pour avoir accepté de m‟encadrer et
diriger tout au long de ces trois années de thèse. Je tiens également à le remercier pour sa
gentillesse et son humour tout aussi bien que pour ses connaissances scientifiques et ses
précieux conseils qui couvrent de larges domaines. Je le remercie également pour les
opportunités d‟enseignement en travaux pratiques et dirigés, volontaires et involontaires, qu‟il
m‟a donné .
Un grand merci à Patrice Gonzalez qui m‟a également encadré et dirigé tout au long de
cette thèse. Je te remercie pour tes conseils et tes réponses à mes multiples questions pas
forcément limitées à la biologie moléculaire ainsi que pour ta confiance. Outre ses qualités
scientifiques je tiens également à souligner ses grandes qualités humaines que sont sa
gentillesse et sa grande disponibilité, et bien sur sans oublier sa capacité surprenante à
toujours avoir un carré de chocolat sous la main.
Je suis particulièrement reconnaissant envers Daniel Brèthes de m‟avoir accueilli au
sein de l‟IBGC pour de longues journées et initié au monde de la biochimie et de la
bioénergétique.
Merci à Olivier Simon de bien avoir voulu se déplacer sur Arcachon et d‟avoir partagé
ses connaissances concernant la reproduction des poissons zèbres. Tu possèdes en effet des
compétences bien singulières dans ce domaine car ta simple présence a amené les poissons à
se reproduire.
Merci à Gilles Durrieu pour ses conseils avisés concernant les analyses statistiques que
j‟ai été amené à faire. Je tiens également à te remercier pour ton aide dans le mondee obscur
et énigmatique de la programmation.
Mes remerciements vont également à l‟ensemble de l‟équipe, et tout particulièrement
Nathalie, Pierre et Bruno pour leur humour et leur gentillesse.
Je fais un clin d‟œil tout particulier à Florence et à Cathy pour leur bonne humeur et
leur aide quotidienne pour passer outre les méandres administratifs qui sont si nombreux et
surgissent toujours où on les attend le moins.
Je tiens aussi fortement à remercier les doctorants qui partagent le même challenge que
moi : Mohamedou, Ika, Adeline, Simona, Sophie et Nicolas
Je tiens également à remercier sincèrement ma famille pour son soutien et son
réconfort. Je tiens également à remercier mes amis qui ont été pour moi une bouffée d‟air pur
tout au long de cette thèse.
Et enfin un énorme merci à toi mon ange pour ton soutien permanent et ta gentillesse
et cela malgré la distance et de bien avoir voulu me partager avec mes recherches se
prolongeant bien souvent pendant les weekends.



i

Sommaire

Introduction p 1
I/ Les différents sites pollués par le Hg p 2
II/ Le cycle biogéochimique du Hg p 6
A/ La spéciation chimique du mercure p 6
B/ Les transformations chimiques du mercure dans les milieux aquatiques p 6
1/ Les réactions d‟oxydoréduction p 6
2/ Les réactions de méthylation-déméthylation du mercure p 8
III/ Bioaccumulation et bioamplification du mercure dans les organismes aquatiques p 10
A/ La bioaccumulation du Hg par les organismes aquatiques p 10
B/ Biodisponibilité du Hg, interactions et transferts au travers des barrières
biologiques p 11
C/ Impacts cellulaires d‟une exposition au Me Hg p 14
D/ Mécanismes de protection des organismes contre le mercure p 16
IV/ Problématique p 17

Matériel et méthodes p 19
I/ Modèle biologique p 20
II/ Contamination de la nourriture p 20
III/ Contamination des poissons p 21
IV/ Dosage Hg p 21
V/ Génétique p 22
A/ Méthode appliquée au clonage d‟un gène d‟intérêt et à l‟étude de sa foncp 22 tion
B/ Analyse de la génotoxicité du MeHg p 26
C/ Analyse de la réponse génétique des tissus à une exposition au MeHg p 29
D/ Analyse du profil de l‟expression génétique d‟un tissu par utilisation de la
technique SAGE p 31
VI/ méthodes biochimiques appliquées à l‟analyse des impacts du MeHg sur les
mitochondries p 37
A/ Respiration sur fibres musculaires perméabilisées p 37
B/ Respiration sur cerveau p 39
C/ Isolement de la fraction mitochondriale p 39
I
D/ Le western-blot p 40
VII/ Analyses histologiques appliquées à l‟étude des fibres musculaires et du cerveau du
poisson zèbre p 40
A/ Préparation des échantillons pour la microscopie optique et électronique p 40
B/ L‟autométallographie p 41
VIII/ Etude de la reproduction des poissons p 41

Chapitre 1 : Analyse de la génotoxicité du MeHg dans le muscle
squelettique et le cerveau p 42
1-I/ Utilisation de la RAPD et de PCR quantitative en temps réel pour détecter les effets
génotoxiques du MeHg p 43
1-II/ Validation de l‟utilisation de la technique RAPD par l‟étude de la cgéiténotox d‟un ai utre
métal : le cadmium p 50

Chapitre 2 : Approche génétique de l’impact de la contamination au
méthylmercure p 83
2-I/ Analyse SAGE sur le muscle squelettique p 85
2-II/ Exploitation expérimentale à partir des données SAGE : le cas de Laptm4    p 111
2-III/ Analyse génétique de voies spécifiques du système nerveux central p 115

Chapitre 3 : Analyse des effets histologiques et bioénergétiques d’une
contamination par le méthylmercure p 122
3-I/Etude sur fibre musculaire p 123
3-II/Etude sur le cerveau p 133

Chapitre 4 : Impact du méthylmercure sur la reproduction du poisson
zèbre p 138
Conclusion et Perspectives p 146
Références bibliographiques p 152
Annexes p 173

II











Introduction















1























Principales mines de mercure Ceinture mercurifère

Figure 1 : Localisation des différentes zones mercurifères de la planète et des
principales mines de mercure (d‟après Beneš et Havlík, 1979, modi fié).








I/ Les différents sites pollués par le Hg.
Le mercure (Hg) est un métal présent naturellement dans les sols. Cependant ce métal
n‟est pas réparti de façon homogène dans l‟écorce terrestre, il se trouve naturellement
concentré au niveau de certaines zones géologiques dites actives formant ainsi les « ceintures
mercurifères » (Figure 1). Cette zone mercurifère se trouve principalement au niveau de
différentes failles autour du Pacifique, la faille himalayenne et le bassin méditerranéen ainsi
que le long de la dorsale atlantique. Le mercure se retrouve également, à des concentrations
supérieures au bruit de fond géologique, dans des zones extérieures à cette ceinture comme
par exemple les régions nord-tempérées et boréales (Suède, Finlande, Nord Québec…) ain