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Investigation of the relative conformational stability of protein mutants by molecular dynamics simulation [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Cristian Danciulescu

127 pages
Investigation of the relative conformational stabilityof protein mutantsby molecular dynamics simulationVon der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften derRheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachenzur Erlangung des akademischen Grades eines Doktorsder Naturwissenschaften genehmigte Dissertationvorgelegt vonDiplom-ChemikerCristian DanciulescuausScarisoara, RumänienBerichter: Prof. Dr. Dr. h. c. Hartwig HöckerProf. Dr. Franz-Josef WortmannTag der mündlichen Prüfung: 26. April 2004Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschule online verfügbar.AcknowledgementsFirst of all I would like to thank Professor Hartwig Höcker and Professor Franz-JosefWortmann for giving me the opportunity for the PhD study at DWI and for honouring meby accepting to be the promoters of my thesis. I deeply appreciate their careful readingand critical comments on my thesis. Particularly, I wish to thank Prof. Wortmann forcreating such a warm and personal atmosphere in his group.My greatest appreciation goes also to my thesis adviser PD Dr. Birgitta Nick, whointroduced me into the world of computer simulation and shared with me her scientificknowledge and experience. I wish to thank her for helping me through all the stages ofmy PhD study. Especially in the later stages of writing my thesis she proved to be a veryexigent reader and, with her suggestions and corrections, improved so much the clarity ofthis text.
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Investigation of the relative conformational stability
of protein mutants
by molecular dynamics simulation
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der
Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Diplom-Chemiker
Cristian Danciulescu
aus
Scarisoara, Rumänien
Berichter: Prof. Dr. Dr. h. c. Hartwig Höcker
Prof. Dr. Franz-Josef Wortmann
Tag der mündlichen Prüfung: 26. April 2004
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschule online verfügbar.Acknowledgements
First of all I would like to thank Professor Hartwig Höcker and Professor Franz-Josef
Wortmann for giving me the opportunity for the PhD study at DWI and for honouring me
by accepting to be the promoters of my thesis. I deeply appreciate their careful reading
and critical comments on my thesis. Particularly, I wish to thank Prof. Wortmann for
creating such a warm and personal atmosphere in his group.
My greatest appreciation goes also to my thesis adviser PD Dr. Birgitta Nick, who
introduced me into the world of computer simulation and shared with me her scientific
knowledge and experience. I wish to thank her for helping me through all the stages of
my PhD study. Especially in the later stages of writing my thesis she proved to be a very
exigent reader and, with her suggestions and corrections, improved so much the clarity of
this text. Thank you, Gitta, for everything!
I owe a very special thank to Prof. Crisan Popescu. His help during the last years was
essential not only in my researches but also for my scientific formation. I will always
remember the scientific discussions we had, and his vast knowledge and experience. I
want to thank him for always spreading optimism and enthusiasm and for always being
willing to give advice and support.
I would like to express my gratitude to my friends Alina, Cristina, Udo, Misti and Rafijul
for supporting me in many occasions during this work and for all the time we spent
together. I am thankful to Misti for the invaluable German lessons he gave me; I was
always amazed of his ability of selecting essential words and phrases to introduce into
my vocabulary.
My thanks go also to the following former and present colleagues from DWI for the
pleasant atmosphere they created, for parties and numerous other events: Jati and
Andreas K, Jutta and Joachim Q, Robert and Alexa, Klaus, Candy, Badmaa, Jagaa.
Especially I want to mention Jati and Andreas for their hospitality and for being such
friendly persons. I will always remember the meetings in their house.
Last but not least, I would like to thank my parents and my sister for always
understanding and supporting me.Contents
Zusammenfassung 3
Abstract 6
1 Introduction 9
2 Molecular dynamics simulation 10
2.1 Force fields 11
2.1.1 Bonded interactions 14
2.1.2 Non-bonded interactions 16
2.1.3 Determination of interaction parameters 17
2.2 Basic concepts of MD simulation 18
2.2.1 Integration algorithms 18
2.2.2 Boundary conditions 20
2.2.3 Statistical mechanics concepts: ensemble and phase space 22
2.2.4 Temperature computation and control 24
2.2.5 Pressure computation and control 25
2.2.6 Constraint algorithms 27
3 Protein structure and dynamics 29
3.1 Basics of protein structure 29
3.2 Protein motions 33
4 Free energy calculations on protein stability 35
4.1 Basic formulation of free energy 35
4.2 Methods for computation of free energy differences 36
4.2.1 Thermodynamic integration 37
4.2.2 Perturbation method 38
4.3 Implementation of free energy calculation methods 40
4.4 Modelling the stability of protein mutants 43
5 Computational resources and MD simulation tests 46
5.1 Computational resources 46
5.1.1 Overview of GROMACS features 46
5.2 Free energy calculations on a test system: BC-cold shock protein 48
5.2.1 Methodology 49
15.2.2 Simulation setup 52
5.2.3 Results 54
5.2.4 Conclusions 56
576 Structural stability of wild type and mutated α-keratin fragments
576.1 Structure of α-keratin fibers
606.1.1 Role of the consensus motif of 2B in the stability of the IF
636.1.2 Mutations in hair keratin
646.1.3 Insights into the IF structure and dynamics by MD simulation methods
666.2 Structure and dynamics of the selected IF segments
696.2.1 MD simulation setup and analysis
726.2.2 Results of MD simulations using the twin-range cutoff method
726.2.2.1 Dynamics of the wild type and mutated sg_helix
746.2.2.2 Dynamics of the wild tyutated coiled-coil
766.2.3 Results of the MD simulations using the PME method
766.2.3.1 Dynamics of the sg_helix-wild-type
776.2.3.2 Dynamics of the sg_helix-mutated
786.2.3.3 Dynamics of the coiled-coil-wild-type
796.2.3.4 Dynamics of the coiled-coil-mutated
826.2.4 Discussion of the conformational stability analyses
836.2.5 Electrostatic interactions in the coiled coil interface
896.2.6 Dynamic properties of the Glu413 and Lys413 side chains
906.2.6.1 Dynamics of Glu413 in a single helix and in a coiled coil
926.2.6.2 Dynamics of Lys413 in a single helix and in a coiled coil
946.2.7 Summary of the MD results
976.3 Thermodynamics of the interactions in the wild-type and mutated coiled coil
segments studied by free energy calculations
976.3.1 Methodology
1026.3.2 Simulation setup
1036.3.3 Dynamics of the hybrid residues
1046.3.4 Results of the free energy calculations on Glu413Lys
1086.3.5 Results of the free energy calculations on Glu413Asp
1117 Conclusions
1138 Bibliography
2Zusammenfassung
Durch die in letzter Zeit stetig gestiegene Leistungsfähigkeit der Rechner sowie die
parallele, kontinuierliche Weiterentwicklung geeigneter Simulationswerkzeuge ist es
heutzutage möglich, mit Hilfe von Computersimulationen die Struktur und Dynamik
komplexer Systeme in atomarer Auflösung zu untersuchen. Diese Entwicklung geht einher
mit der Enstehung einer Vielzahl verschiedener Software-Pakete, sowohl akademischer
Gruppen wie auch von Software Firmen. Heutzutage stehen akademischen
Forschungseinrichtungen einige dieser an Hochschulen entwickelten Software-Pakete –
wie z. B. GROMACS – zu reinen Forschungszwecken kostenlos unter GNU General Public
License zur Verfügung und eröffnen damit neue, kostengünstige Forschungsmöglichkeiten.
In dieser Arbeit wird das GROMACS Software-Paket verwendet, um die Stabilität
verschiedener Segmente von α-Keratin Intermediärfilamenten (IF) mit Hilfe
molekulardynamischer (MD) Simulationen zu untersuchen. Vorangegangene MD-
Simulationen haben bereits das temperaturabhängige Verhalten kleiner α-helikaler
Segmente eines Wollkeratins erforscht. Aufgrund der damals verfügbaren Rechnerleistung
konnten die Simulationen nur im Vakuum durchgeführt werden. Diese Einschränkung fällt
heutzutage weg, und es werden in dieser Arbeit komplexere Systeme in wässriger
Umgebung untersucht.
Es ist das Ziel dieser Arbeit den Einfluss experimentell verifizierter Punktmutationen auf
die Struktur und die Stabilität von Segmenten der Monomereinheit humaner Haarkeratine
sowie auf die Struktur der untersten Aggregationsebene der IF - der coiled-coil-Struktur -
mit Hilfe von MD-Simulationen zu untersuchen. Mutationen im terminalen Helix-Motiv
des menschlichen Haarkeratin-Gens hHb6 scheinen mit der erblichen Haarkrankheit
Monilethrix verknüpft zu sein. Die dabei am häufigsten festgestellten Mutationen sind
Glu413Lys und Glu413Asp. Beide Mutationen liegen im C-terminalen Bereich der
stäbchenförmigen Hauptdomäne des IF.
Zur Untersuchung des Einflusses der Mutationen werden zwei Strategien verfolgt.
Zunächst werden MD-Simulationen durchgeführt, die das dynamische Verhalten und die
temperaturabhängige Stabilität verschiedener IF Segmente erfassen. Weiterhin wird ein
thermodynamischer Ansatz gewählt, der es gestattet, die relative Stabilität der IF-Segmente
aus der mit der Mutation einhergehenden Änderung der freien Energie zu bestimmten.
3Für die Simulationen werden zwei α-Keratin Segmente vom C-Terminus des helikalen 2B-
Segments ausgewählt, und zwar zum einen als isolierte α-Helix zum anderen als coiled-
coil-Struktur. Neben den nativen Segmenten werden ebenfalls Segmente definiert, bei
denen die Aminosäurereste in Position 413 durch die experimentell bekannten Mutationen
ersetzt sind. Mit den so entstandenen sechs IF-Systemen werden MD-Simulationen bei
variierender Temperatur in wässriger Umgebung über 1 ns Simulationszeit durchgeführt.
Dabei werden die ionisierbaren Aminosäureeinheiten (Glu, Asp, Lys und Arg) in
geladenem Zustand betrachtet; dies ist bei Simulationen in wässriger Umgebung
notwendig. Die elektrostatischen Wechselwirkungen werden unter Verwendung zweier
verschiedener Methoden berechnet: der twin-range cutoff Methode sowie dem Particle-
Mesh Ewald (PME) Algorithmus.
Die Auswertung der MD-Trajektorien zeigt für alle untersuchten Systemen eine Zunahme
der Destabilisierung der helikalen Anfangsstrukturen mit steigender
Simulationstemperatur. Die Destabilisierung beginnt dabei regelmäßig am C-Terminus der
Struktur. Dieses Verhalten wird sowohl für die MD-Simulationen mit dem cutoff-
Verfahren wie auch bei Verwendung des PME Algorithmus beobachtet. Es kann jedoch
kein signifikanter Unterschied im dynamischen Verhalten oder in der strukturellen
Stabilität des Hauptkettenatome der nativen und punktmutierten Strukturen festgestellt
werden.
Dagegen zeigt eine detaillierte Analyse der Diederwinkel der Seitenketten Unterschiede in
den Wechselwirkungen von Glu413 in der nativen coiled-coil-Struktur und Lys413 in der
mutierten coiled-coil-Struktur. Aufgrund der speziellen räumlichen Anordnung der
Aminosäureeinheiten in der coiled-coil-Grenzfläche wechselwirken Glu413 bzw. Lys413
der A-Kette mit Asp364 der B-Kette der coiled-coil-Struktur. Es zeigt sich, dass das Paar
Lys413-Asp364 beinahe über die gesamte Simulationszeit eine Salzbrücke bildet. Dagegen
bevorzugt das Paar Glu413-Asp364 größere Atomabstände. Dieses Verhalten führt zu
einer unterschiedlichen Ausrichtung der Seitenketten in der coiled-coil-Struktur, die
drastische Auswirkungen auf die IF-Struktur haben könnte. Gerade die Änderung der
Ladung von –1 (im Fall von Glu) auf +1 (im Fall von Lys) scheint die unterschiedlichen
Wechselwirkungen und damit die unterschiedliche Ausrichtung der Seitenketten zu
verursachen. Inwieweit dieses Verhalten weitere Auswirkungen auf die IF-Struktur und
insbesondere auf die Dimer/Dimer-Wechselwirkungen zeigt, können die hier
durchgeführten MD-Simulationen nicht zeigen.
4Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Änderung der freien Energie aufgrund der Mutation
berechnet. Dazu wird zunächst ein Hybridmodell entwickelt und getestet, das die nicht-
physikalische Transformation eines Aminosäurerestes in einen Aminosäurerest anderer
chemischer Zusammensetzung modelliert. Für die Glu zu Lys Mutation wird danach an der
-1
Einzelhelix eine Änderung der freien Energie von ∆G = -110 ± 5 kJ mol berechnet, in der
-1
coiled-coil-Struktur beträgt der entsprechende Wert ∆G = -164 ± 18 kJ mol . Diese
Ergebnisse deuten wiederum ein Stabilisierung der Struktur aufgrund der Glu413Lys
Mutation an und zeigen somit Übereinstimmung mit den Ergebnissen der
Diederwinkelbetrachtungen aus den MD-Simulationen. Der Austausch von Glu durch Lys
verringert die Abstoßung der Cluster Glu-Gly-Clu413-Glu (A-Kette) und Glu-Ser-Glu-Asp
(B-Kette) signifikant. Diese Beobachtung kann durch die verringerte Beweglichkeit der
Lysin-Seitenkette erklärt werden, die nicht mehr frei rotieren kann und abstoßende
Wechselwirkungen durch ihre Umgebung erfährt.
Für die Mutation Glu zu Asp wird im Fall der Einzelkette und wie auch in der coiled-coil-
-1Struktur die Änderung der freien Energie aufgrund der Mutation zu ∆G = 0,8 kJ mol
-1 bzw. ∆G = -0,6 kJ mol berechnet. Diese kleine Änderung in der freien Energie entspricht
der Erwartung, da auch schon in den MD-Simulationen nur geringe Änderungen der
Wechselwirkungen beobachtet werden. Aus den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten
Rechnungen ist somit die Schlussfolgerung zu ziehen, dass die Glu zu Asp Mutation – im
Gegensatz zur Glu zu Lys Mutation - keine signifikante Änderung der Stabilität der coiled-
coil-Struktur verursacht.
Schlussfolgernd kann aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten
Modellierungen spekuliert werden, dass die weitere Aggregation der coiled-coil-Strukturen
in höher geordnete Systemen durch die Glu413Lys Mutation - insbesondere durch die
Umorientierung der Seitenkette des mutierten Aminosäurerestes - beeinflusst wird. In
einem wesentlich geringeren Maße könnte dies auch für die Glu413Asp Mutation
zutreffen, wo ebenfalls günstigere Dimer-Dimer Wechselwirkungen die weitere
Aggregation beeinflussen. Inwieweit diese Änderungen der atomaren Wechselwirkungen
für das Erscheinungsbild der Haarkrankheit Monilethrix verantwortlich sind, kann nur
durch weitere Untersuchungen der Dimer-Dimer-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene
beurteilt werden.
5Abstract
During the last two decades the rapid increase of computer power accompanied by the
continuous development of advanced simulation methodologies have made it possible to
use computer simulations to investigate the structure and dynamics of molecular systems
on the atomistic level. These developments induced the coding of a large number of
molecular simulation software packages both in academia and by software companies.
Today some high performance software packages from academic groups – i. e. GROMACS -
are available as free downloads under GNU General Public License for academic research.
These offer a great molecular modelling research potential for a relatively low budget.
In this thesis the GROMACS software package is used to study the conformational stability
of different α-keratin intermediate filament (IF) segments by means of molecular dynamics
(MD) simulations. Previous MD studies already investigated the temperature dependent
behavior of small α-helical segments of wool keratins. Due to the limitations of the
computer resources at that time, the calculations were mainly carried out in vacuum.
Nowadays, the available computer resources have overcome some of these limitations.
Hence, in this thesis more complex IF systems, such as coiled coil segments, can also be
simulated in an explicit water environment.
It is the objective of this work to investigate by MD simulation the influence of
experimentally verified point mutations on the structure and conformational stability of
segments of the human hair monomeric IF unit as well as on their lowest aggregation level,
namely the coiled coil structure. Mutations in the helix termination motif of human hair
keratin gene hHb6 seem to be connected to the hereditary hair dystrophy Monilethrix. The
most common mutations reported are Glu413Lys and Glu413Asp, located at the C-
terminal end of the coiled coil 2B- rod domain of the IF.
This study follows two approaches. First, MD simulation aims to reveal features of the
dynamical behavior and the temperature dependent stability of IF segments. Secondly, a
thermodynamic approach based on free energy calculations aims to reveal the energetic
consequences due to amino acid mutations and to determine the relative stability of the
wild type and mutated segments.
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