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L'AFADINE est un marqueur de mauvais pronostic des carcinomes mammaires impliqué dans la régulation de la migration cellulaire, Afadin is an adverse prognosis marker in breast carcinomas involved in the regulation of cell migration

De
200 pages
Sous la direction de Marc Lopez
Thèse soutenue le 25 juin 2010: Aix Marseille 2
Le cancer du sein est la maladie la plus fréquente chez la femme. Les biomarqueurs sont devenus un centre d’intérêt majeur de la recherche en cancérologie afin d’améliorer le diagnostic et le pronostic, de contrôler la progression de maladie, de prévoir les rechutes et d’augmenter l'efficacité des traitements thérapeutiques. Pendant mon doctorat, nous avons caractérisé l’afadine comme un marqueur de mauvais pronostic dans le cancer du sein. L’afadine est une protéine échafaudage, exprimée de façon ubiquitaire, qui régule la formation et la stabilité des jonctions épithéliales. La perte d'expression de l’afadine dans 14.5 % des carcinomes mammaires est corrélée avec un mauvais pronostic et une diminution de la survie sans métastases à 5 ans. La perte d'expression de l’afadine est corrélée avec une cassure au niveau du site fragile commun en 6q26, FRA6E, où le gène AF6/MLLT4 est localisé. Ces données suggèrent qu'AF6/MLLT4 pourrait être un gène de progression tumorale dont la perte est un marqueur de mauvais pronostic. Le but de mon étude a ensuite été d'analyser la conséquence fonctionnelle de l'extinction de l’afadine en utilisant des modèles in vitro et in vivo. Nous avons constaté que la diminution stable de l'expression de l’afadine mène à une augmentation marquée de la migration cellulaire spontanée et induite. Cette augmentation de la migration cellulaire est associée à une activation des voies de signalisation Src et Ras/MAPK. De plus, la diminution stable de l'expression de l’afadine entraîne une augmentation de la croissance tumorale dans la glande mammaire de souris. Ceci est la première démonstration du rôle clé de l’afadine dans la progression tumorale.
-Afadine
-Cancer du sein
-Migration cellulaire
Breast cancer is the most frequent malignancy among women. Biomarkers have become a major focus of cancer research in order to improve diagnosis and prognosis, monitor disease progression, predict relapse and increase therapeutic treatment efficacy. During my PhD, we identified afadin as an adverse prognosis marker in breast cancer. Afadin is a ubiquitously expressed scaffold protein that regulates epithelial junction formation and stability. Loss of afadin expression in 14.5% of breast carcinomas is correlated with poor outcome with reduced 5 years metastasis free survival. Loss of afadin expression correlates with a break in a common fragile site at 6q26, FRA6E, where the AF6/MLLT4 gene is located. This data suggests that AF6/MLLT4 could be a tumor progression gene whose loss is a marker of adverse prognosis. The aim of my study was then to analyze the functional consequence of afadin extinction using in vitro and in vivo models. We found that stable knockdown of afadin expression leads to a marked increase of spontaneous and induced cell migration. Increase of cell migration is concomitant with activation of the Src and Ras/MAPK pathways. Afadin extinction leads to increase tumour growth in mouse mammary gland. This is the first demonstration of afadin as a key protein involved in tumor progression.
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22012/document
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ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE – AIX-MARSEILLE II

FACULTE DES SCIENCES DE LUMINY


THESE DE DOCTORAT


Pour l’obtention du grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE LA
MEDITERRANEE

Discipline: Immunologie



L’AFADINE est un marqueur de mauvais pronostic
des carcinomes mammaires impliqué dans la
croissance tumorale et la migration cellulaire



Présentée et soutenue publiquement par

Gaëlle Fournier

Le 25 juin 2010

Laboratoire d’Oncologie Moléculaire
Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
INSERM UMR891


JURY


Président: Pr Philippe NAQUET

Rapporteurs: Dr Marie-Christine RIO
Dr Frédéric LUTON

Examinateurs: Dr Daniel BIRNBAUM
Dr Patrice DUBREUIL
Dr Maxime LEHMANN

Directeur de thèse: Dr Marc LOPEZ
























2Remerciements

Ce travail s’est déroulé au Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille-
UMR891 dirigé par la directrice Françoise BIRG et le directeur adjoint Jean-Paul
BORG. Ce travail, encadré par le Docteur Marc LOPEZ, a débuté dans l’équipe du
Docteur Patrice Dubreuil et s’est terminé dans l’équipe du Docteur Daniel
BIRNBAUM. Je vous remercie, Patrice et Daniel, de m’avoir accueilli dans votre
équipe, de m’avoir soutenue et de me faire l’honneur d’être membre du jury de ma
thèse.

Je tiens à remercier Marc LOPEZ pour l’attention avec laquelle il a dirigé ce travail
et pour ses conseils scientifiques qui m'ont été d'une grande utilité pour
l'aboutissement de ce travail. Je te remercie de m’avoir initié au monde de la
recherche et de m’avoir permis de conduire ce travail de façon autonome.

Je remercie le Professeur Philippe NAQUET de me faire l’honneur de présider mon
jury de thèse et les Docteurs Marie-Christine RIO et Frédéric LUTON d’avoir
accepté de juger ce travail et d’être les rapporteurs de ma thèse. Je remercie le
Docteur Maxime LEHMANN pour ces encouragements depuis le Master et pour
avoir accepté d’être l’examinateur de mon jury de thèse.

Je tiens à remercier l’Ecole Doctorale pour toutes les formations auxquelles j’ai eu la
chance de participer. Elles m’ont été utiles au cours de ma thèse et le seront surtout
pour ma future carrière professionnelle (bilan de compétences, communication,
propriétés industrielles, gestion des Entreprises, etc.).

Un grand merci à toutes les personnes du CRCM, de l’équipe d’Oncologie Moléculaire
et des DUB qui m’ont soutenu et encouragé durant ces 4 années. Un merci tout
particulier pour tous mes collègues et amis qui m’ont accompagné, de près ou de
loin, et qui par leur bonne humeur, leur disponibilité et leurs compétences ont
contribué à ma réalisation personnelle et professionnelle – ceux qui sont déjà partis:
Sarah et Carole, Amélie, Aude, Bruno, Cyril, Jenifer, Pierre, Nico et ceux qui
seront toujours là après mon départ: Amandine, Ana, Caro, Claire, Fatima, Flo,
Julie R, Olivier, Marie-Laure T, Rémy C, Seb …merci à tous!!!!

Un clin d’œil à ma famille et mes amis… à mes parents, Emmanuelle, Florence et
Jean-Charles, les Embahagauch’ (Dim, Greg, Jérôme et Cyril), Flo et Adrien, Richard,
Nico, Stéph…et Alex!!!!!
3























4Table des matières

Prologue ..................................................................................................... 13

Introduction ................................................................................................ 15

Partie I: Les carcinomes mammaires ........................................................... 17
A. Le processus de cancérisation de la glande mammaire ............................ 17
1. Le processus de cancérisation........................................................... 17
2. La glande mammaire et les carcinomes .............................................. 21
3. Les cellules épithéliales à l’origine des carcinomes mammaires .............. 23
B. Epidémiologie des carcinomes mammaires............................................. 25
1. L’incidence des carcinomes mammaires.............................................. 25
2. Les facteurs de risque des carcinomes mammaires .............................. 26
C. Le dépistage, le diagnostic, la classification, le pronostic et les thérapies des
carcinomes mammaires .......................................................................... 27
1. Le dépistage................................................................................... 27
2. Le diagnostic.................................................................................. 28
3. La classification histologique............................................................. 28
4. La classification moléculaire.............................................................. 30
5. Les marqueurs diagnostiques et pronostiques des carcinomes mammaires
........................................................................................................ 31
a. Les marqueurs utilisés en clinique: ................................................. 32
b. Les marqueurs à l’étude: .............................................................. 34
6. Les thérapies.................................................................................. 35
7. Les orientations pour le futur............................................................ 38

Partie II: L’afadine .................................................................................... 41
A. L’afadine dans la physiologie des jonctions épithéliales............................ 41
1. Découverte de l’afadine.................................................................... 41
2. Structure de l’afadine ...................................................................... 42
a. Les isoformes et les homologues de l’afadine ................................... 42
b. La structure et les domaines de liaison des isoformes de l’afadine....... 43
3. Expression de l’afadine .................................................................... 45
a. L’expression de l’afadine ............................................................... 45
b. La dégradation de l’afadine............................................................ 45
54. L’afadine et son rôle dans la polarité épithéliale................................... 46
a. La polarité épithéliale ................................................................... 46
b. Le rôle de l’afadine dans la polarité épithéliale.................................. 48
5. L’afadine et la signalisation cellulaire ................................................. 63
a. La signalisation cellulaire............................................................... 63
b. Le rôle de l’afadine dans la signalisation cellulaire............................. 64
6. L’afadine et son rôle dans l’adhérence cellulaire à la matrice extracellulaire
........................................................................................................ 70
a. L’adhérence cellulaire à la matrice extracellulaire.............................. 70
b. Le rôle de l’afadine dans l’adhérence à la matrice extracellulaire via la
protéine de signalisation Rap1........................................................... 71
7. L’afadine et son rôle dans la survie cellulaire....................................... 72
8. L’afadine et son rôle dans la migration cellulaire.................................. 74
a. La migration cellulaire................................................................... 74
b. Le rôle de l’afadine dans la migration cellulaire................................. 77
9- Autre fonction de l’afadine…au niveau des neurones ............................ 82
B. L’afadine dans un contexte pathologique ............................................... 83
1. Propagation du virus Herpès............................................................. 83
2. Cancer .......................................................................................... 83
a. Leucémies................................................................................... 83
b. Cancer de l’ovaire ........................................................................ 85
c. Cancer du sein:............................................................................ 85

Objectifs de l’étude ...................................................................................... 87
I. Contexte de l’étude................................................................................ 89
II. Objectifs de l’étude ............................................................................... 90

Résultats .................................................................................................... 93

I. Etude de l'apport de l’afadine dans la classification des carcinomes mammaires:
.............................................................................................................. 95
Article 1: Correlated break at PARK2/FRA6E and loss of AF-6/Afadin protein
expression are associated with poor outcome in breast cancer. Letessier, A. et al.
(2007). Oncogene 26(2): 298-307. ............................................................. 95

6II. Expression de l’afadine dans les lignées cellulaires issues de carcinomes
mammaires.............................................................................................107
A. Données d’expression protéique de l’afadine .........................................108
B. Données d’expression transcriptionnelle du gène MLLT4, codant pour l’afadine
..........................................................................................................108
C. Données génomiques, en CGH array, de la région contenant le gène MLLT4,
codant pour l’afadine.............................................................................110

III. Diminution de l’expression de l’afadine, par ARN interférence, dans des lignées
cellulaires issues de carcinomes mammaires................................................111
A. Développement et validation d’outils destinés à diminuer l’expression de
l’afadine ..............................................................................................111
1. La technique d’ARN interférence par miRNA .......................................111
2. Validation des ARN interférents ciblant l’afadine .................................113
3. Système permettant de réduire l’expression de l’afadine de façon inductible
et réversible......................................................................................115
a. Validation du système inductible et réversible in vitro.......................116
b. Validation du système inductible et réversible in vivo .......................118
B. Analyse des conséquences fonctionnelles de la perte d’expression inductible
et réversible d’afadine dans des lignées cellulaires issues de carcinomes
mammaires..........................................................................................119
1. Etude du pouvoir tumorigène in vivo.................................................119
2. Etudes in vitro ...............................................................................121
C. Analyse des conséquences fonctionnelles de la perte d’expression d’afadine
dans des lignées cellulaires issues de carcinomes mammaires:....................122
Article 2: AF-6/Afadin protein, a marker of poor outcome in breast cancer, that
negatively regulates cell migration (pour soumission à Oncogene). ..............122

Discussion..................................................................................................153
Quels sont les mécanismes aboutissant à la perte d’expression de l’afadine ? ...155
Quel est l’intérêt clinique du marqueur afadine ? ..........................................157
La perte d’expression de l’afadine a-t-elle un rôle dans la progression tumorale ?
.............................................................................................................158

Annexe......................................................................................................169
Bibliographie ..............................................................................................181
7



































8Liste des abréviations

ABP (Actin-Binding Protein): protéine de liaison à l’actine
ACE: Antigène Carcino-Embryonnaire
ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease): métalloprotéase et désintégrine protéine
ADIP (Afadin DIL domain-Interacting Protein): protéine de liaison à l’afadine avec un
domaine DIL
ADN: Acide Désoxyribo-Nucléique
AF6 (ALL1 fused gene from chromosome 6): gène de fusion avec ALL1 sur le
chromosome 6
ALL-1 (acute lymphoblastic leukemia (ALL)-1 gene): gène des leucémies aigues
lymphoblastiques
ARN: Acide Ribo-Nucléique
ARNm: ARN messager

BRCA (BReast Cancer): antigène relatif au cancer du sein

CA15.3 (Cancer Antigen 15.3): antigène du cancer 15.3
CAM (Cell Adhesion Molecule) : molécule d’adhérence cellulaire
CGH (comparative genomic hybridization): hybridation génomique comparative
CISH (chromogenic in situ hybridization): hybridation chromogénique in situ

EGF (Epidermal Growth Factor): facteur de croissance épidermique
EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor): récepteur au facteur de croissance
épidermique
EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition): transition épithélio-mésenchymateuse
ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase): kinase de régulation des signaux
extracellulaires
ES (embryonic stem cells): cellules souches embryonnaires

FAK (Focal Adhesion Kinase): kinase des adhérences focales
FGF (Fibroblast Growth Factor): facteur de croissance fibroblastique
FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor): récepteur au facteur de croissance
fibroblastique
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization): hydridation fluorescente in situ

9GAP (GTPase Activating Proteins): protéine d’activation
GDP: Guanosine Di-Phosphate
GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor): facteur d’échange de nucléotide
GTP: Guanosine Tri-Phosphate

Ig: Immunoglobuline
IGF (Insulin-like Growth Factor): facteur de croissance semblable à l’insuline
IRM: Imagerie à Résonance Magnétique

JAM (Junctional Adhesion Molecule): molécule d’adhérence jonctionnelle
JNK (c-Jun N terminal Kinase): protéine kinase de c-Jun

kb: kilobase
kDa: kiloDalton

MAGUK (Membrane Associated GUanylate Kinase): Guanylate kinase associée à la
membrane
MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase): protéine kinase mitogénique
MMP (Matrix Metalloprotease): métalloprotéase de la matrice

PDGF (Platelet-Derived Growth Factor): facteur de croissance dérivé des plaquettes
PDGFR (Platelet-Derived Growth Factor Receptor): récepteur au facteur de
croissance dérivé des plaquettes
PDZ: Post synaptic Disc-large Zona
PI3K (Phospho-Inositide 3-Kinase): kinase 3 des phospho-inositides

RE: Récepteur aux Estrogènes
ROCK (Rho-Associated Protein Kinases): kinases des protéines Rho
RP: Récepteur à la Progestérone
RTK: Récepteur à activité Tyrosine Kinase

SFIg: Superfamille des Immunoglobulines
SH domain (Src Homology domain): domaine d’homologie à Src

TNF (Tumor Necrosis Factor): facteur nécrotique tumoral
TMA: Tissue Micro Array
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