Manipulation of the mouse genome by transposon and recombinase techniques [Elektronische Ressource] / Laura Schebelle

Laura Schebelle

Sujets

• Biologie

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 28
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 13 Mo

Extrait

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN



Lehrstuhl für Entwicklungsgenetik




Manipulation of the Mouse Genome
by Transposon and Recombinase Techniques



Laura Schebelle



Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur
Erlangung des akademischen Grades eines



Doktors der Naturwissenschaften



genehmigten Dissertation.





Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. M. Klingenspor
Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. W. Wurst
2. Univ.-Prof. A. Schnieke, PhD




Die Dissertation wurde am 03.08.2009 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 23.11.2009 angenommen. Contents
1 Abstract 9
2 Introduction 11
2.1 Forward Genetics -
Random Mutagenic Screens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2 Transposon Mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.2.1 Picking the Transposon System . . . . . . . . . . . . . 13
2.2.1.1 Sleeping Beauty . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.1.2 PiggyBac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.2 Setting up the in vivo Mutagenic Screen . . . . . . . . 19
2.2.3 Transposon Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.4 Generation of the Transposase Expressing Mouse Line 20
2.2.5 of the Transposon Harboring Line 22
2.3 Flp RMCE Efficiency Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3 Materials 25
3.1 Instruments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2 Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3 Consumables and Others . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.4 Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.5 E. coli Strains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.6 Enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4 Methods 31
4.1 Molecular Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1.1 Standard Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1.2 Individual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1.2.1 Southern Probes . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1.2.2 General PCR techniques . . . . . . . . . . . 31
4.1.2.3 PCR Analysis prior to RMCE . . . . . . . . . 32
4.1.2.4 PCR after RMCE . . . . . . . . . . 33
12 CONTENTS
4.1.2.5 Splinkerette PCR of T2onc Insertion Sites . . 33
4.2 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.2.1 General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.2.2 Transfections . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.2.2.1 C31 Mediated RMCE in Targeted Rosa26
Locus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.2.2.2 PiggyBac Mediated Random Insertions . . . 36
4.2.2.3 Transposon Random Integration . . . . . . . 36
4.2.2.4 PiggyBac in vitro Excision Assay . . . . . . . 36
4.2.2.5 FlpO RMCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.2.2.6 Cre Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.2.2.7 SB100X T . . . . . . . . . . . . . . 37
4.3 Animal Housing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5 Results 39
5.1 Vectors and Cloning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
5.1.1 Gateway Two-Component System for RMCE . . . . . 39
5.1.1.1 Destination Vector . . . . . . . . . . . . . . . 39
5.1.1.2 Entry Vector . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.1.1.3 Gateway Reaction for Final Exchange Vector 44
5.1.2 Rosa26 RMCE Vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5.1.3 PiggyBac Venus Transposon . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.1.4 External Vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.1.4.1 Plasmids for C31 RMCE . . . . . . . . . . . 50
5.1.4.2 for Flp and CRE Excision . 51
5.1.4.3 Plasmids for Further Cloning . . . . . . . . 53
5.2 Transposase Expressing Cells and Mice . . . . . . . . . . . . 55
5.2.1 C31 Mediated RMCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.2.1.1 Integration of piggyBac and Sleeping Beauty . 55
5.2.1.2 Analysis of Transposases in vivo and in vitro 57
5.3 Transposon Harbouring Cells and Mice . . . . . . . . . . . . 59
5.3.1 Random Insertion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.3.1.1 Cotransfection of Transposon and Helper
Plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.3.1.2 Pronucleus Injection . . . . . . . . . . . . . . 60
5.4 Mouselines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.4.1 External Mouselines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.4.2 Generated . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.4.3 Breeding Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
5.5 RMCE Efficiency Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5.5.1 RMCE using FlEx Gene Trap Clones . . . . . . . . . . 66
5.5.1.1 In vitro Excision of Selection Marker . . . . . 72
5.5.1.2 Mobilisation of dsRed by Sleeping Beauty Trans-
posase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75CONTENTS 3
6 Discussion 77
6.1 General Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
6.2 Flp-mediated Cassette Exchange . . . . . . . . . . . . . . . . 78
6.2.1 Efficiency of Flp-mediated RMCE . . . . . . . . . . . 78
6.2.2 Reliability of RMCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
6.2.3 Importance of Frame . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
6.2.4 Subsequent in vitro Approaches . . . . . . . . . . . . . 81
6.2.4.1 Cre-mediated Deletion . . . . . . . . . . . . 81
6.2.4.2 Sleeping Beauty Mobilization . . . . . . . . . 81
6.2.5 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
6.3 In vivo Transposon-based Mutagenic Screen . . . . . . . . . . 82
6.3.1 Sleeping Beauty M3a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
6.3.2 PiggyBac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
6.3.3 Comparison with Recent Experimental Studies . . . . 83
6.3.3.1 Limitations of the Sleeping Beauty M3a Screen 84
6.3.3.2 of the piggyBac Screen . . . . . . 87
6.3.3.3 In vivo Detection . . . . . . . . . . . . . . . . 87
6.3.3.4 In vitro Application . . . . . . . . . . . . . . 88
6.4 Perspectives of Mouse Insertional Mutagenesis . . . . . . . . 88
A Abbreviations 101
B Acknowledgements 1054 CONTENTSList of Figures
2.1 Forward genetic random insertional mutagenic screens . . . 13
2.2 DNA cut-and-paste transposon system . . . . . . . . . . . . 14
2.3 Transposase domains and Overexpression Inhibition . . . . 16
2.4 Footprint and precise cut-and-paste transposition . . . . . . 17
2.5 Schematic outline of transposon insertion in an intron of an
endogenous gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.6 Schematic outline of a transposon-based in vivo screen . . . 21
2.7 drawing of C31 RMCE in targeted ES cells . . . . 22
2.8 Outline of possible events mediated by Cre or Flp recombi-
nase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
4.1 General PCR Conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.2 PCR analysis of FlEx gene trap clones . . . . . . . . . . . . . 33
4.3 PCR Analysis of RMCE clones . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.4 Splk PCR primer and programs . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.1 Cloning strategy of pEX-Flp/pDEST . . . . . . . . . . . . . . 40
5.2 Reading frames of . . . . . . . . . . . . . . 41
5.3 Gateway reaction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.4 Cloning strategy of pENTR-T2B-Neo . . . . . . . . . . . . . . 44
5.5 of pENTR-T2B-OPSVenus for in vivo mu-
tagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
5.6 Cloning strategy of pENTR-EX for RMCE efficiency studies 46
5.7 Gateway reaction of pDEST and pEX-Flp . . . . . . . . . . . 47
5.8 Gateway reaction of pENTR-EX and pEX-FLP . . . . . . . . 48
5.9 Cloning of Caggs promoter driven piggyBac vectors . . . . . 50
5.10 of C31 exchange vectors harbouring PiggyBac trans-
posase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.11 Cloning of C31 exchange vectors it SB100X and
optimized it PiggyBac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.12 Integration of Venus cassette in PiggyBac transposon . . . . 53
5.13 Plasmids for C31 RMCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.14 and PCR screens for Flp RMCE . . . . . . . . . . . 55
5.15 Schematic drawing of C31 RMCE in targeted ES cells . . . . 56
5.16 Southern blot screen of C31 of SBM3a . . . . . . . . . 57
56 LISTOFFIGURES
5.17 Southern blot screen of C31 RMCE of iPB, mPB and SB100 . 58
5.18 Western Blot analysis of SBM3a expressing mouse tissue . . 59
5.19 RT-PCR of iPB expressing mouse tissue . . . . . . . . . . . . 60
5.20 In vitro excision assay of mPB expressing ES cells . . . . . . . 61
5.21 Random integration of pDEST-TPOPS . . . . . . . . . . . . . 62
5.22 of PB transposons . . . . . . . . . . . . . 63
5.23 Breeding schemes of in vivo mutagenic transposon screen . 65
5.24 Overview of breedings and screened mice . . . . . . . . . . . 66
5.25 Southern Blot analysis of T2onc breedings, SB11 vs. SBM3a . 67