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Mecanismes impliques dans la formation des anomalies chromosomiques lors de la meiose en absence de brca2 chez la plante arabidopsis thaliana., Mechanisms involved in the formation of chromosomal abnormalities during meiosis in the absence of Brca2 in Arabidopsis thaliana

De
354 pages
Sous la direction de Marie-pascale Doutriaux, Ariane Gratias-weill
Thèse soutenue le 21 juin 2011: Paris 11
En phase somatique, plusieurs mécanismes de réparations de l’ADNinterviennent pour réparer les cassures double brin (CDB) de l’ADN. Enphase méiotique, les CDB de l’ADN engendrées de façon programmées parSpo11 sont réparées par la recombinaison homologue (RH) dont les acteursprincipaux sont Rad51 et Dmc1 aidés de Brca2. Chez Arabidopsis, en absencede Brca2, le déroulement méiotique est perturbé, les chromosomes nes’associent pas en bivalents, ils apparaissent emmêlés. Ainsi, en absencede Brca2, la recombinaison homologue pourrait ne plus être fonctionnelleet les anomalies chromosomiques observées pourraient être le résultat deréparations aberrantes des CDB de l’ADN effectuée par d’autres mécanismesde réparation de l’ADN. Nous avons montrés, chez Arabidopsis, que le Nonhomologous End Joining (NHEJ) et/ou le Single Strand Annealing (SSA),mécanismes de réparation des CDB de l’ADN en phase somatique,n’intervenaient pas en phase méiotique dans la formation des anomaliesobservées en absence de Brca2. Toujours dans l’hypothèse où ces figuresméiotiques soient le résultat de liaisons covalentes, nous avons regardési les ADN-ligases ne pourraient pas être impliquées. Ainsi, nous avons pumontrer que la Ligase 6, ADN-ligase spécifique des plantes, n’avait pas derôle dans les anomalies chromosomiques observées en méiose en absence deBrca2. D’ailleurs la Ligase 6 ne semble pas non plus intervenir dans lesfigures chromosomiques observées chez les mutants rad51 et mnd1. Le rôlede la Ligase 6 n’ayant pas été déterminé lorsque nous avons démarré cetravail, nous avons voulu identifier son le rôle en étudiant le mutantcorrespondant. Le mutant ligase 6 ne présente pas de sensibilité auxstress génotoxiques utilisés ce qui indique que la Ligase 6 ne semble pasintervenir dans la réparation de l’ADN. La mutation dans le gène LIGASE Iest létal à l’état homozygote, de plus nous avons pu observer uneségrégation anormale chez l’hétérozygote mutant pour le gène LIGASE I. Lalétalité du mutant ligase I a été contournée par l’utilisation d’unsystème ARNi pour éteindre l’expression du gène LIGASE I uniquement enméiose. Cependant, l’implication de la Ligase I, dans les anomaliesméiotiques observées en absence de Brca2 n’a pas pu être déterminée.Enfin, nous avons confirmé que, chez Arabidopsis, Xrcc4 avait un rôle dansle NHEJ via son interaction avec la Ligase IV et via la sensibilité dumutant xrcc4 à différents stress génotoxiques. En revanche, Xrcc4-like nesemble pas interagir avec les acteurs du complexe de ligation du NHEJ etle mutant ne présente pas de sensibilité aux stress génotoxique, indiquantque cette protéine n’est pas impliquée dans le NHEJ et plus généralementdans les mécanismes de réparation de l’ADN.
-Arabidopsis
-Réparation de l’ADN
-Brca2
-ADN-ligases
-Méiose
In somatic cells, several mechanisms are involved in the repair of DNAdouble strand breaks (DSB). In meiotic cells, programmed DSBs are causedby Spo11 and repaired by homologous recombination (HR), whose main playersare Rad51 and Dmc1 aided by Brca2. In Arabidopsis, in the absence ofBrca2, meiosis is disturbed, chromosomes do not organize into bivalents,they appear stuck and entangled together. Thus, in the absence of Brca2,HR may be no functional and the chromosomal anomalies we observecouldresult from the aberrant repair of the DNA DSBs due to other mechanisms ofDNA repair. We have shown in Arabidopsis that the homologous end joining(NHEJ) and/or Single Strand Annealing (SSA), mechanisms of DNA DSB repairthat are active in the somatic phase, were not involved in the formationof the meiotic anomalies observed in the absence of Brca2 in meioticcells. Still assuming that these figures are the result of meioticcovalent bond, we checked whether DNA ligases could be involved. Thus, wehave shown that 6 Ligase, DNA ligase specific plants, had no role in thechromosomal abnormalities observed in meiosis in the absence of Brca2.Besides the Ligase 6 does not seem to interfere with the meiotic figuresobserved in rad51 and mnd1 mutants. We wanted to identify the Ligase 6role in studying its mutant. Ligase 6 mutant did not show sensitivity togenotoxic stress. The Ligase 6 does not seem to be involved in DNA repair.The lethality of the ligase I mutant was bypassed with a RNAi constructaimed at extinguishing the gene expression of LIGASE I atmeiosis only.However, the involvement of Ligase I in the meiotic anomalies observed inthe absence of Brca2 could not be determined. Finally, we confirmed that,in Arabidopsis, Xrcc4 has a role in NHEJ through its interaction withligase IV and the sensitivity of the xrcc4 mutant to different genotoxicstress. In contrast, Xrcc4-like does not appear to interact with playersin the NHEJ ligation complex and the mutant shows no sensitivity togenotoxic stress. These result indicated that this protein is not involvedin NHEJ and, more generally in the mechanisms of DNA repair.
-Arabidopsis
-DNA repair
-Brca2
-DNA ligases
-Meiosis
Source: http://www.theses.fr/2011PA112086/document
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Thèse de Doctorat

Pour obtenir le grade de
Docteur en Sciences de l’Université Paris 11, Orsay
Ecole Doctorale : Sciences du Végétal

Présentée par Marilyn Dumont


Mécanismes impliqués dans la formation des anomalies chromosomiques
lors de la méiose en absence de Brca2 chez Arabidopsis thaliana




Composition du jury :

Mme Valérie Borde Rapporteur
Mme Marie-Pascale Doutriaux Directrice de thèse
Mme Ariane Gratias Weill Co-directrice de thèse
Mme Mathilde Grelon Examinateur
M Thierry Lagrange Rapporteur
Mme Annie Sainsard Présidente du jury

tel-00632489, version 1 - 14 Oct 2011

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Présentée par Marilyn Dumont


Mécanismes impliqués dans la formation des anomalies chromosomiques
lors de la méiose en absence de Brca2 chez Arabidopsis thaliana




Composition du jury :

Mme Valérie Borde Rapporteur
Mme Marie-Pascale Doutriaux Directrice de thèse
Mme Ariane Gratias Weill Co-directrice de thèse
Mme Mathilde Grelon Examinateur
M Thierry Lagrange Rapporteur
Mme Annie Sainsard Présidente du jury

tel-00632489, version 1 - 14 Oct 2011

tel-00632489, version 1 - 14 Oct 2011Remerciements


J’exprime toute ma gratitude à Valérie Borde, Thierry Lagrange, Mathilde Grelon et Annie
Sainsard pour avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse.
Je remercie très chaleureusement Marie-Pascale Doutriaux de m’avoir accueilli dans son
équipe pendant ma thèse. Et je ne saurais jamais assez remercier ma « maman scientifique »
Ariane Gratias Weill. Toutes deux ont su m’encadrer, me transmettre leur savoir et leur goût
pour la recherche. Merci à Sophie également d’avoir été ma co-équipière de manip’ et bien
souvent de galère. Je tiens également à remercier les autres membres de cette chaleureuse
équipe, Nicolas, Emeline, et tous les petits stagiaires qui ont rythmés ces années de thèse :
Sandie, Guillaume, les pious-pious, Daniels, Nelly …
Merci à l’ensemble de l’IBP, des personnes formidables et de grande culture scientifique, ces
quelques années passées avec vous ont été très enrichissantes.
Merci à tous les thésards avec qui j’ai passé ces quelques années, on s’est épaulé et bien
souvent réconforté mais on a aussi bien rigolé.
Enfin, je tiens à remercier mon entourage personnel. A mes parents qui m’ont permis d’avoir
pu faire de longues études, à Cédric pour m’avoir soutenu et pour partager ma vie, à ma petite
sœur que j’aime de tout mon cœur, à Dodie, Mémé et Pépé, qui n’aura pas vu l’aboutissement
de ce travail, à mes copines qui sont un réel soutien dans ma vie, je vous adore, à mon armée
de choc de nounous, sans vous, rien n’aurait été possible, à mes p’tits mecs : Kiki et Jeff, et
enfin à mon fils, Mylan, merci d’illuminer ma vie.
tel-00632489, version 1 - 14 Oct 2011

tel-00632489, version 1 - 14 Oct 2011Abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
ADNg : ADN génomique
ADN-T : ADN de Transfert
ARN : acide ribonucléique
ARNi : ARN interférence
ATP : adénosine triphosphate
At : Arabidopsis thaliana
BER : Base Excision Repair
CDB : Cassures doubles brin
CO : Crossing Over
Col0 : Columbia (écotype)
CS : complexe synaptonémal
DSB : cassures simple brin
DAPI : 4’,6-diamidino-2_phenylindol
dNTP : deoxynucleosides triphosphate
Ec : Escherichia coli, E. coli
EA : Elément Axial
EC : Elément Central
EL : Elément Latéral
Gy : Gray
Hs : Homo Sapiens, humain
MMR : Mismatch Repair
MMS : Methyl méthane sulfonate
NHEJ : Non Homologous End Joining
NER : Nucleotide Excision repair
Pb : paires de bases
tel-00632489, version 1 - 14 Oct 2011

tel-00632489, version 1 - 14 Oct 2011PCR : Polymérase Chain Reaction
RH : Recombinaison Homologue
Sc : Saccharomyces cerevisiae
SSA : Single Strand Annealing
TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transférase dUTP Nick End Labbelling
UV-C : ultra violet C
WT : Wild Type
5-FU : 5-fluorouracile

Convention : GENE, Protéine, mutant
tel-00632489, version 1 - 14 Oct 2011

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