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Molecular pathways important for the pathogenesis and risk stratification of childhood T-ALL [Elektronische Ressource] / presented by Corinne Kox

131 pages
DISSERTATION SUBMITTED TO THE COMBINED FACULTIES FOR THE NATURAL SCIENCES AND FOR MATHEMATICS OF THE RUPERTO-CAROLA UNIVERSITY OF HEIDELBERG, GERMANY FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF NATURAL SCIENCES PRESENTED BY CORINNE KOX -MASTER BIOLOGY BORN IN LUXEMBOURG, LUXEMBOURG ORAL EXAMINATION: MOLECULAR PATHWAYS IMPORTANT FOR THE PATHOGENESIS AND RISK STRATIFICATION OF CHILDHOOD T-ALL REFEREES: DR. Andreas Ladurner PROF. DR. Christof Niehrs Summary Paediatric T-cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL) is a rare type of cancer that represents 10-15% of ALL cases. Intensified chemotherapy led to improvements of the overall survival rates of childhood T-ALL, reaching approximately 80%. However, the prognosis of relapses remains poor, emphasising the need for new molecular markers that identify high risk patients in the earliest stages of the disease. In addition, understanding of the precise mechanisms of T-ALL leukaemogenesis allows for the development of molecular targeted therapies that could potentially improve the quality of life of children with T-ALL, in general, and the response in patients that develop recurrent disease, in particular. Frequent genetic abnormalities in T-ALL are mutations in the NOTCH pathway which are thought to drive T-ALL development.
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DISSERTATION

SUBMITTED TO THE
COMBINED FACULTIES FOR THE NATURAL SCIENCES AND FOR
MATHEMATICS
OF THE
RUPERTO-CAROLA UNIVERSITY OF HEIDELBERG, GERMANY
FOR THE
DEGREE OF DOCTOR OF NATURAL SCIENCES












PRESENTED BY

CORINNE KOX -MASTER BIOLOGY
BORN IN LUXEMBOURG, LUXEMBOURG

ORAL EXAMINATION:














MOLECULAR PATHWAYS IMPORTANT FOR THE
PATHOGENESIS AND RISK STRATIFICATION OF
CHILDHOOD T-ALL












REFEREES:

DR. Andreas Ladurner
PROF. DR. Christof Niehrs




Summary

Paediatric T-cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL) is a rare type of cancer that
represents 10-15% of ALL cases. Intensified chemotherapy led to improvements of the overall
survival rates of childhood T-ALL, reaching approximately 80%. However, the prognosis of
relapses remains poor, emphasising the need for new molecular markers that identify high risk
patients in the earliest stages of the disease. In addition, understanding of the precise
mechanisms of T-ALL leukaemogenesis allows for the development of molecular targeted
therapies that could potentially improve the quality of life of children with T-ALL, in general, and
the response in patients that develop recurrent disease, in particular. Frequent genetic
abnormalities in T-ALL are mutations in the NOTCH pathway which are thought to drive T-ALL
development.
In the first part of this study, the prognostic and predictive value of mutations in the NOTCH
pathway was investigated in T-ALL patients, at initial presentation and at relapse. Activating
mutations in the NOTCH1 gene and inactivating mutations in the FBXW7 gene, encoding for a
negative regulator of the pathway, were correlated with early treatment response and long-term
outcome. At initial presentation, NOTCH1 mutated patients treated according to the ALL-BFM
2000 protocol show improved early treatment response and better long-term outcome.
Interestingly, the NOTCH1 effect is restricted to the ALL-BFM 2000 good responders only. In the
high risk group, patients with and without NOTCH1 mutations do not show a significant difference
in long-term outcome. In contrast, inactivation of the FBXW7 protein correlates with excellent
early response, but does not associate with better long-term outcome. At relapse, event-free
survival rates were low in the ALL-REZ 2002 study, not exceeding 40%. In particular, FBXW7
mutated patients with recurrent disease showed a poor response to treatment. This study laid
foundations for the possible application of molecular markers in T-ALL risk stratification.
In the second part of this PhD work, the effect of up-regulated NOTCH signalling on microRNA
expression was analysed to gain insight into the pathogenic mechanisms of NOTCH1 in T-ALL. In a
cell-based assay, NOTCH1 was knocked down in a T cell line and mature microRNA expression was
monitored by microarray profiling. Two normalisation methods were employed for the microarray
analysis. The first method identified 5 microRNAs down-regulated upon NOTCH1 knock-down,
including members of the miR-17~92 and miR-106~363 clusters. However, no major changes in
miRNA expression were observed when using the second normalisation method. The validation
of the microarray experiments by microRNA-specific quantitative PCR confirmed the results from
the second microarray normalisation method. In comparison, a qPCR approach detected a down-
regulation of primary microRNA transcripts, such as the transcript of the miR-17~92 cluster. In a

second setting, the effect of NOTCH1 mutations on microRNA expression was determined in
primary T-ALL patient samples. Marginal differences in expression were detected in members of
the miR-17~92 cluster and the miR-181 family. Further work will be required to elucidate the
mechanism of action of miRNA regulation by NOTCH1 in T-ALL.












































Zusammenfassung

Die T Zell lymphoblastische Leukämie (T-ALL) ist ein seltener Krebstyp, der meistens bei
Kindern auftritt, und nur 10-15% der ALL ausmacht. Die Krankheit zeichnet sich in den letzten
Jahren durch immer höhere Überlebenschancen aus. Eine Ausnahme stellen rezidivierte Patienten
dar, weswegen die Früherkennung von Hochrisikopatienten und deren schnelle intensive
Therapie besonders wichtig ist. Eine individuelle Behandlung ab der Diagnose könnte die
Überlebensrate der Hochrisikopatienten verbessern. Um die Diagnose des Rezidivrisikos sicher
vorhersagen zu können, fehlen allerdings zuverlässige Marker. Des Weiteren ist es wichtig die
Mechanismen der Pathogenese der T-ALL besser zu verstehen und hierauf aufbauend
zielorientierte Therapien zu entwickeln. Individuelle Behandlungen könnten die Lebensqualität
der Kinder mit T-ALL, und auch speziell das Therapieansprechen von rezidivierten Patienten
verbessern. Häufige genomische Veränderungen in der T-ALL sind Mutationen im NOTCH
Signalweg, die auch mitverantwortlich sind für die Entwicklung der Leukämie.
Im ersten Teil der vorliegenden Studie wurden die Mutationen in Genen des NOTCH-Signalweges
mit der Prognose der T-ALL Patienten korreliert. NOTCH1 enthält aktivierende Mutationen in 50%
der Patienten, während FBXW7, ein Repressor von NOTCH1, inaktiviert wird durch Mutationen in
weniger als 20% der T-ALL Patienten. Diese Mutationen wurden verglichen mit dem Ansprechen
auf die Therapie, sowie mit dem Langzeitergebnis in der Erstdiagnose und im Rezidiv. In der
Erstdiagnose der ALL-BFM 2000 Studie konnte ein positiver Effekt von NOTCH1 Mutationen auf
das Therapie- und das Lanzeitergebnis nachgewiesen werden. Der NOTCH1-Effekt konnte lediglich
in den Patienten festgestellt werden, die gut auf die Therapie angesprachen. In der Gruppe der
Hochrisikiopatienten übte die NOTCH1 Mutation keinen Unterschied auf die Überlebensrate aus.
Inaktivierende FBXW7 Mutationen korrelierten auch mit exzellentem Ansprechen der Patienten,
es konnte allerdings keine Assoziation zwischen diesem Typ Mutation und eines verbesserten
ereignisfreiem Überleben festgestellt werden. In Übereinstimmung mit den Erwartungen,
überschritt die Überlebensrate bei rezidierten Patienten der ALL-REZ 2002 nicht mehr als 40%.
Insbesondere Patienten mit FBXW7 Mutationen schlugen allgemein schlecht auf die
Rezidivtherapie an. Diese Studie hat den Grundstein für den möglichen klinischen Gebrauch von
Mutationen des NOTCH Signalweges gelegt.
Im zweiten Teil dieser Studie wurde der Effekt von NOTCH1 Mutationen auf die Expression von
microRNAs untersucht, um die Konsequenzen der NOTCH1 Aktivierung zu verstehen. In einem
Zell-basierten Assay, wurde NOTCH1 in einer T-Zelllinie herabreguliert und die Expressionsprofile
von reifen microRNA-Molekülen mit einer Microarray-Analyse untersucht. Zwei
Normalisierungsmethoden wurden für die Analyse angewendet. Die erste Methode identifizierte

5 microRNA-Moleküle, die herabreguliert waren, darunter Mitglieder der miR-17~92 und miR~106-
363 Cluster. Eine zweite Normalisierung konnte dagegen keinen Unterschied in den
Expressionsprofilen von Kontroll- und NOTCH1-herabregulierten Experimenten aufzeigen. Die
spezifische Amplifizierung der microRNA-Kandidaten durch quantitative PCR (qPCR) bestätigte
die Resultate der zweiten Normalisierungsmethode, da keine Unterschiede in der Expression der
microRNA-Moleküle entdeckt werden konnten. Die qPCR-Analyse konnte allerdings zwei primäre
microRNA-Transkripte identifizieren, die nach einer Herabregulation von NOTCH1 ebenfalls
herabreguliert waren: die Transkripte des miR-17~92-und des miR-491-Clusters. Zusätzlich wurden
microRNA-Profile von T-ALL-Erstdiagnoseproben auf den Effekt von NOTCH1 Mutationen
überprüft. Marginale Unterschiede in der Expression von microRNA-Molekülen aus dem miR-
17~92-Cluster und der miR-181-Familie wurden ermittelt. Zukünftige Studien werden notwendig
sein, um die genauen Mechanismen der miRNA-Regulation von NOTCH1 in T-ALL zu untersuchen.



































Dedicated to my family























Table of Contents
Table of Contents

Table of contents i
List of Figures vi
List of Tables viii
Abbreviations ix
Acknowledgements xiii

1. Introduction 1-21

1.1 Paediatric T-cell Acute Lymphoblastic Leukaemia 1

1.2 The NOTCH pathway in paediatric T-ALL 5
1.2.1 NOTCH1, a transmembrane receptor with a transcription activating
function 5
1.2.1.1 The structure and the function of NOTCH1 5
1.2.1.2 The role of NOTCH1 in haematopoiesis 7
1.2.1.3 The role of NOTCH1 in paediatric T-ALL 8
1.2.2 FBXW7, a negative regulator of the NOTCH pathway 10

1.3 MiRNAs in paediatric T-ALL 12
1.3.1 MicroRNA biogenesis 12
1.3.2 MicroRNAs in haematopoiesis 16
1.3.3 MicroRNAs in cancer 18
1.3.4 MicroRNAs and the NOTCH pathway 18

1.4 Molecular markers in paediatric T-ALL 20

1.5 Aim of the present study 21

2. Experimental procedures 22-36

2.1 Materials 22

2.1.1 Frequently used reagents and chemicals 22
i Table of Contents

2.1.2 Enzymes 22
2.1.3 Buffers, Solutions and Media 22
2.1.4 Kits 24
2.1.5 Plasmids 24
2.1.6 Oligonucleotides 25
2.1.7 Bacterial strains 27
2.1.8 Cell lines 27

2.2 Methodologies 28

2.2.1 Molecular Biology 28
2.2.1.1 Polymerase chain reaction (PCR) 28
2.2.1.2 Transformation of bacteria 28
2.2.1.3 Bacterial culture and isolation of plasmid DNA 29
2.2.1.4 Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation 29
2.2.1.5 Genomic DNA extraction 29
2.2.1.6 Determination of DNA concentration and quality 29
2.2.1.7 DNA agarose gels 30
2.2.1.8 Total RNA extraction 30
2.2.1.9 Determination of RNA concentration and quality 30
2.2.1.10 cDNA synthesis and quantitative PCR 30
2.2.1.10.1 Quantitative PCR for mRNA 30
2.2.1.10.2 miQPCR 31

2.2.2 Cell culture 32
2.2.2.1 Freezing and thawing cell lines 32
2.2.2.2 Lentiviral production 33
2.2.2.3 Lentiviral titration 33
2.2.2.4 Lentiviral transduction 34
2.2.2.5 Cell fixation 34
2.2.2.6 Determination of transduction efficiency 34
2.2.2.7 Calculating the lentiviral titre 34

2.2.3 MiRNA microarray analysis 35

ii Table of Contents

2.2.4 Statistical analysis 36

3. Results 1: The role of NOTCH1 and FBXW7 mutations as molecular biomarkers
in paediatric T-ALL 37-55

3.1 NOTCH1 and FBXW7 mutations in paediatric T-ALL at initial presentation 37

3.1.1 Frequency of NOTCH1 and FBXW7 mutations in paediatric T-ALL
at initial presentation 37
3.1.2 NOTCH1 mutations correlate with improved early treatment response
and a better long-term outcome 38
3.1.3 The favourable effect of NOTCH1 mutations is restricted to the
standard and intermediate risk groups 40
3.1.4 FBXW7 inactivating mutations correlate with early treatment response
but do not predict favourable late treatment response or better
long-term outcome 43
3.1.5 The combination of NOTCH1 and FBXW7 mutations results in
excellent early treatment response but does not signify a more
favourable long-term outcome 45

3.2 NOTCH1 and FBXW7 mutations in paediatric T-ALL at relapse 48

3.2.1 Clinical characteristics of the cohort of relapsed T-ALL patients 48
3.2.2 Frequency of NOTCH1 and FBXW7 mutations in paediatric T-ALL at relapse 50
3.2.3 At relapse, NOTCH1 or FBXW7 mutations can be lost or newly acquired 51
3.2.4 FBXW7 mutations tend to predict poor long-term outcome in relapse
T-ALL 53

4. Results 2: Characterisation of miRNA expression in paediatric T-ALL 56-70

4.1 miRNA expression is dependent on NOTCH1 56

4.1.1 Knock-down of NOTCH1 decreases proliferation of a T cell line 56
4.1.2 MiRNAs are differentially expressed upon NOTCH1 knock-down 58
iii

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