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New approaches to the chemotherapy of glioblastoma [Elektronische Ressource] : investigations on doxorubicin nanoparticles, inhibition of PDGF receptors and kinesin Eg5, with emphasis on confocal laser-scanning microscopy / vorgelegt von Dietmar Gross

De
210 pages
New Approaches to the Chemotherapy of Glioblastoma: investigations on doxorubicin nanoparticles, inhibition of PDGF receptors and kinesin Eg5, with emphasis on confocal laser-scanning microscopy Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie - der Universität Regensburg vorgelegt von Dietmar Gross aus Schwäbisch Gmünd 2006 Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juli 2002 bis August 2006 unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer sowie von Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt am Institut für Pharmazie der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie - der Universität Regensburg. Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im August 2006. Tag der mündlichen Prüfung: 24. August 2006. Prüfungsausschuss: Prof. Dr. O. Reiser (Vorsitzender) Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter) Prof. Dr. G. Bernhardt (Zweitgutachter) Prof. Dr. S. Elz (Drittprüfer) Für meine Eltern “It is easier to work hard, than to undo the testimony of laziness.” J. Bachmann Mein Dank geht an: Herrn Prof. Dr. A.
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New Approaches to the Chemotherapy of Glioblastoma:
investigations on doxorubicin nanoparticles, inhibition of
PDGF receptors and kinesin Eg5, with emphasis on
confocal laser-scanning microscopy





Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie -
der Universität Regensburg

















vorgelegt von
Dietmar Gross
aus Schwäbisch Gmünd
2006


Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juli 2002 bis August 2006 unter der Leitung
von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer sowie von Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt am Institut für
Pharmazie der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie - der Universität
Regensburg.





















Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im August 2006.

Tag der mündlichen Prüfung: 24. August 2006.

Prüfungsausschuss:
Prof. Dr. O. Reiser (Vorsitzender)
Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter)
Prof. Dr. G. Bernhardt (Zweitgutachter)
Prof. Dr. S. Elz (Drittprüfer)
















Für meine Eltern
















“It is easier to work hard, than to undo the testimony of laziness.”
J. Bachmann

Mein Dank geht an:

Herrn Prof. Dr. A. Buschauer, für das Ermöglichen dieser Arbeit in seinem Arbeitskreis, für
sein großes Engagement in der Förderung meiner Arbeit, für seine stetige persönliche
Unterstützung und sein stets offenes Ohr für alle vorgebrachten Anliegen während der
Promotionszeit.

Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt, für seine wissenschaftliche Anleitung, für seine Anregungen
und auch für konstruktive Kritik, sowie für seine ständige und geduldige Hilfsbereitschaft bei
vielen Problemstellungen der täglichen Laborarbeit.

Herrn Prof. Dr. J. Kreuter (Universität Frankfurt) und seinen Mitarbeitern, für die
Bereitstellung der PBCA Nanopartikel und damit verbundener Messdaten, sowie für die
wissenschaftliche Zusammenarbeit.

Herrn Prof. Dr. A. Giannis (Universität Leipzig) und seinen Mitarbeitern, für die
Bereitstellung der Monastrol-Analoga, sowie für die wissenschaftliche Zusammenarbeit.

Herrn Prof. Dr. F. Böhmer (Universität Jena), für das Bereitstellen der Swiss 3T3 Zellen,
sowie Herrn Dr. R. Gastpar (Klinikum der Universität Regensburg), für das Bereitstellen der
K-562 Zellen.

Herrn Prof. Dr. A. Göpferich und seinen Mitarbeitern, für die Bereitstellung von Messgeräten,
insbesondere des Konfokalmikroskops.

Herrn Prof. Dr. O. Wolfbeis und seinen Mitarbeitern, sowohl für die Bereitstellung des
Aminco Bowman Fluorimeters, als auch für die wissenschaftliche Beratung.

Herrn O. Merkel, Herrn Dr. C. Lottner, sowie Herrn Dr. C. Scherübl, für das Bereitstellen von
Lokalisationsvektoren und Fluoreszenzfarbstoffen.

Frau S. Bollwein für die Einweisung in Zellkulturarbeiten, für die Durchführung der
Mykoplasmentests, sowie für die Durchführung von Chemosensitivitätstests.

Frau E. Schreiber, für die Hilfe und Beratung bei der Durchführung von Kalzium-Assays, für
die Mitbetreuung von Zellkulturen, sowie für die angenehme Laborgesellschaft über einen
wesentlichen Teil der Promotionsdauer.

Frau S. Heinrich, Frau M. Luginger und Herrn P. Richthammer, die durch ihre Hilfe bei
Organisation und bei der Lösung von technischen Problemen meine Arbeit oft wesentlich
erleichtert haben.


Herrn Dr. R. Ziemek und Frau E. Hofinger, für ihre beratende Unterstützung bei
gentechnischen Arbeiten, an Frau C. Müller und Frau Dr. M. Hubensack, für die
Unterstützung und Durchführung von Calcein-AM- sowie Mitoxantron-Assays, sowie an
Herrn H. Preuss, für seine Hilfe bei der Bearbeitung und Erstellung von Molekül-
Darstellungen.

Meinen Studienkollegen Herrn Dr. E. Schneider, der mir in mannigfacher Hinsicht eine
wissenschaftliche sowie persönliche Unterstützung über die gesamte Dauer der Promotion
gewesen ist.

Alle meine Kollegen, für ihre Geduld, die sie manchmal im Umgang mit mir aufbringen
mussten.




Weiterhin geht mein besonderer Dank an:

Meinen Labor- und Studienkollegen Herrn Peter Jarzyna, der den Laboralltag auf seine ganz
persönliche Art nie hat langweilig werden lassen, und mir oft mit Rat zur Seite gestanden hat.

Meinen Studienkollegen Herrn Dr. Marc Kunze, der mir in der Promotionszeit stets eine
wichtige persönliche Stütze war.

Meinen Studienkollegen Herrn Christian Becker, der meinen Laboralltag oft aufgehellt hat.

Frau Nathalie Pop, die mir insbesondere im letzten Abschnitt der Promotion ein Licht im
Universitätsalltag gewesen ist.

Mister and Misses Keith Klaus, Mister and Misses John Radank, and Mister and Misses Erick
Elkins, for their help in personal and spiritual growth (Pr 27:17).

Meine Familie, die mich während der Promotionszeit beständig und selbstlos getragen und
unterstützt hat.

Miss Stefanie S. Pappas. Her love kept me going through all highs and lows.

Abstracts and Publications

Results of this work were in part published or presented as posters or short lecture prior to
submission of the thesis:

Publications:

• Gross D, Bernhardt G and Buschauer A (2005). Platelet-derived growth factor receptor
independent proliferation of human glioblastoma cells. Turkish Journal of Cancer 35:
40-49 (Poster abstract).

• Müller C, Gross D, Sarli V, Gartner M, Giannis A, Bernhardt G and Buschauer A
(2006). Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues
against human glioblastoma cells. Cancer Chemother Pharmacol.

• Gross D, Bernhardt G and Buschauer A (2006). Platelet-derived growth factor receptor
independent proliferation of human glioblastoma cells: selective tyrosine kinase
inhibitors lack antiproliferative activity. J Cancer Res Clin Oncol 132: 589-99.



Posters and short lecture:

• Annual Meeting of the German Pharmaceutical Society (DPhG) in Regensburg, October
6-8, 2004: Platelet-Derived Growth Factor Receptor Mediated Proliferation of Human
Glioblastoma Cells: Imatinib lacks Antiproliferative Activity (Poster contribution).

• European High-Grade Glioma Meeting Regensburg, February 25–26, 2005: Platelet-
Derived Growth Factor Receptor Independent Proliferation of Human Glioblastoma
Cells (Short lecture).

• Annual Meeting of the German Pharmaceutical Society (DPhG) in Mainz, October 5-8,
2005: Monoaster Formation in Human Glioblastoma Cells: Investigations on New
Monastrol Derivatives (Poster contribution).













I

Contents

Chapter 1
General Introduction ............................................................................................................................................... 1
1.1 Primary malignant brain tumors ........................................................................................................ 1
1.2 Biological peculiarities of astrocytomas............................................................................................ 2
1.3 Tumor resection................................................................................................................................. 3
1.4 Irradiation .......................................................................................................................................... 4
1.5 Chemotherapy.................................................................................................................................... 4
1.5.1 Temozolomide................................................................................................................................... 6
61.5.2 Modulation of O -methylguanine-DNA methyltransferase............................................................... 7
1.5.3 Inhibitors of signal transduction ........................................................................................................ 7
1.6 Summary............................................................................................................................................ 8
Bibliography ......................................................................................................................................................... 10

Chapter 2
Scope and Objectives............................................................................................................................................ 13

Chapter 3
Investigations on doxorubicin-loaded poly-butylcyanoacrylate nanoparticle formulations as an approach to
overcome p-glycoprotein-mediated drug efflux.................................................................................................... 15
3.1 Introduction ..................................................................................................................................... 15
3.1.1 Nanoparticle carrier systems............................................................................................................ 15
3.1.2 The blood-brain barrier.................................................................................................................... 17
3.1.3 Regulation of drug uptake into the brain across the blood-brain barrier ......................................... 19
3.1.4 Targeted drug delivery to the brain.................................................................................................. 21
3.1.4.1 Prodrugs and chemical delivery systems ......................................................................................... 21
3.1.4.2 Carrier- and receptor-mediated transport across the BBB............................................................... 22
3.1.4.3 Liposomal drug carriers................................................................................................................... 23
®3.1.4.4 Tween 80 -coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles 24
®3.1.4.5 Delivery of doxorubicin to the brain via Tween 80 -coated PBCA nanoparticles.......................... 25
3.2 Objective.......................................................................................................................................... 27
3.3 Materials and methods..................................................................................................................... 29
3.3.1 Drugs and chemicals.................. 29
3.3.2 Preparation of polybutylcyanoacrylate nanoparticle formulations .................................................. 29
3.3.3 Cell lines and culture conditions...................................................................................................... 30
3.3.4 Chemosensitivity assay.................................................................................................................... 30
3.3.5 Immunostaining............................................................................................................................... 31
3.3.6 UV-vis and fluorescence spectroscopy............................................................................................ 31
3.3.7 Flow cytometry..................... 32 II

3.3.8 Amplification and purification of localization vectors .................................................................... 33
3.3.8.1 Localization vectors......................................................................................................................... 33
3.3.8.2 Culture media and selection agar..................................................................................................... 34
3.3.8.3 Preparation of competent bacteria ................................................................................................... 34
3.3.8.4 Transformation of E. coli cells ........................................................................................................ 34
3.3.8.5 Plasmid DNA maxipreparation and determination of plasmid DNA .............................................. 35
3.3.8.6 Restriction digest ............................................................................................................................. 35
3.3.8.7 Agarose gelelectrophoresis.............................................................................................................. 35
3.3.9 Transient and stable transfection of human glioblastoma cells ....................................................... 36
3.3.10 Image acquisition of living cells by confocal laser-scanning microscopy....................................... 37
3.3.11 Preparation of fixed samples for confocal laser-scanning microscopy............................................ 37
3.4 Results ............................................................................................................................................. 38
3.4.1 Expression of pgp by human glioblastoma cells and by KBwt and KBv1 cells.............................. 38
3.4.2 Effect of the mode of doxorubicin application on the proliferation of
pgp-overexpressing KBv1 cells....................................................................................................... 40
3.4.3 Flow cytometric quantification of doxorubicin fluorescence associated with glioblastoma
cells after incubation with different doxorubicin formulations........................................................ 46
3.4.4 Flow cytometric determination of cell-associated doxorubicin fluorescence in KB cells ............... 48
3.4.5 Distribution of doxorubicin fluorescence in human glioblastoma cells........................................... 52
3.4.6 Multifluorescence live-cell imaging and colocalization studies ...................................................... 56
3.4.6.1 Fluorescent staining of nuclei in living cells ................................................................................... 56
3.4.6.2 Mitochondrial staining in living cells .............................................................................................. 57
3.4.6.3 CLSM imaging of the plasma membrane ........................................................................................ 64
3.4.6.4 aging of the endoplasmic reticulum in living human glioblastoma cells......................... 66
3.4.6.5 Fluorescently labeled golgi complex in living human glioblastoma cells ....................................... 68
3.4.7 Doxorubicin fluorescence in human glioblastoma cells after incubation with
different doxorubicin formulations.................................................................................................. 70
3.5 Discussion........................................................................................................................................ 73
3.6 Summary.......................................................................................................................................... 77
Bibliography ......................................................................................................................................................... 79

Chapter 4
Investigations on the platelet-derived growth factor receptor as a target for the treatment of malignant brain
tumors ................................................................................................................................................................... 85
4.1 Introduction ..................................................................................................................................... 85
4.1.1 Platelet-derived growth factor (PDGF)............................................................................................ 85
4.1.2 Gene location, biosynthesis and structure of PDGF ........................................................................ 86
4.1.3 Expression of PDGF receptors ........................................................................................................ 88
4.1.4 Gene locations and structure of PDGFRs ........................................................................................ 89
4.1.5 Interaction of PDGF with PDGFR, and PDGF receptor cycle ........................................................ 89
4.1.6 PDGFR-mediated effects................................................................................................................. 90