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Precision measurements with SMI and 4Pi Microscopy [Elektronische Ressource] / presented by David Baddeley

206 pages
Ajouté le : 01 janvier 2008
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Dissertation
submitted to the
Combined Faculties of the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
David Baddeley, MSc (Physics)
born in: Auckland, New Zealand
Oral examination: 31 October 2007Precision measurements with SMI and 4Pi
Microscopy
Referees: Prof. Dr. Cristoph Cremer
Prof. Dr. Josef BillePrecision measurements with SMI and 4Pi Microscopy
Newly developed far fleld light microscopy techniques such as Spatially Modulated Illu-
mination and 4Pi microscopy allow structural measurements on biological objects with
a precision very much better than the conventional imaging resolution. This thesis fo-
cuses on the improvement of this measurement accuracy, encompassing both changes to
the experimental SMI setup and new data analysis procedures. An aberration resistant flt
algorithm for SMI microscopy is presented along with similar model based procedures for
theanalysisof4Piandconfocaldata. Thesearecombinedinaframeworkwhichallowsfor
robust automatic analysis. A method for deconvolving 4Pi data which shows a refractive
index mismatch induced phase shift is also introduced.
The devices and the associated algorithms were applied to various biological problems
mostnotablythesizeofreplicationfociandthestructureoftheinnerkinetochore. Virtual
microscopy simulations were performed to support the interpretation of this data and to
obtain insightintothe results of the SMI gene structure measurements performed byother
group members.
Pr˜azisionsmessungen mittels SMI und 4Pi Mikroskopie
NeuentwickelteMethodenderFernfeld-Lichtmikroskopiewie SpatiallyModulatedIllumi-
"
nation" und 4Pi -Mikroskopie erlauben die Bestimmung von Strukturparametern von bio-
logischenObjektenmiteinerGenauigkeit,diedeutlichbesseralsdieherk˜ommlicheoptische
Au ˜osung ist. Diese Dissertation legt den Schwerpunkt auf die Verbesserung dieser Mess-
˜genauigkeit, wobei sowohl Anderungen des experimentellen Aufbaus des SMI-Mikroskops
als auch neue Methoden der Datenanalyse zum Einsatz kommen. Detailliert beschrieben
wird ein Fit-Algorithmus fur die SMI-Mikroskopie, der gegen Vezerrungen der Punktbild-˜
funktion stabil ist, sowie ˜ahnliche modell-basierende Methoden zur Analyse von 4Pi und
konfokalen Daten. Diese Techniken sind derart zusammengestellt, dass eine robuste auto-
matische Auswertung m˜oglich ist. Eine Methode fur˜ die Entfaltung von 4Pi Bildern, die
durch eine Fehlanpassung des Brechungsindex eine Phasenverschiebung aufweisen, wird
ebenfalls vorgestellt.
DieMikroskopeunddiedamitverbundenenAlgorithmenwerdenaufverschiedenebiolo-
gischeFragestellungen,insbesondereaufdieGro…envonReplikations-fociunddieStruktur˜
des Inner-Kinetochor-Komplexes, angewandt. Es wurden Simulationen, basierend auf vir-
tueller Mikroskopie, durchgefuhrt, um die Interpretation der Daten zu unterstutzen sowie˜ ˜
die Ergebnisse der SMI-Messungen von Gen-Strukturen besser verstehen zu konnen.˜viContents
1 Introduction 1
I Background 5
2 Fluorescence Microscopy 7
2.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2 Image Formation and Resolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.1 Image Formation as a Linear System . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.2 Resolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3 Structured Illumination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.4 I5M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.5 Non-linear Processes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.5.1 Two Photon Excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.5.2 Saturation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.6 Resolution Through Localisation (‘Pointilism’) . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.6.1 SPDM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.6.2 PALM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.6.3 Other Notable ‘Localisation Microscopy’ Examples . . . . . . . . . 15
3 SMI Microscopy 17
3.1 Experimental Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.2 Operating Principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2.1 Excitation Field Synthesis/ More Angles . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.3 Technical Details . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.3.1 Image Acquisition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.3.2 Sample Preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.4 Size Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.4.1 Modulation Contrast/ Modulation Depth . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.4.2 Mo Depth and Size for Spherical Objects . . . . . . . . . . 23
3.5 Distance Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.6 In uence of Object Form . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.6.1 On Size Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
viiviii CONTENTS
3.6.2 On Distance Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.7 Calibration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.7.1 Object Size . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.7.2 Distances /Positions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4 4Pi Microscopy 29
4.1 Optical Setup and Operating Principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.2 Image Processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.2.1 Preprocessing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.2.2 Sidelobe Removal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
5 Biological Structures and Labelling 35
5.1 The Nucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.1.1 Gene Loci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.2 Labelling Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.2.1 DAPI, Phalloidin, Lipophile Dyes etc... . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.2.2 Immunolabelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.2.3 Conventional FISH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
5.2.4 COMBO-FISH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5.2.5 Fluorescent Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5.2.6 Other . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5.3 Labelling and Sampling. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5.3.1 Sampling theory applies to band-limited signals . . . . . . . . . . . 42
5.3.2 Labelling takes discrete values and is not uniformly spaced . . . . . 42
5.3.3 Rule of thumb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
5.3.4 Labelling E–ciency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
5.4 Fixation and Embedding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
6 Parameter Estimation and Deconvolution 47
6.1 Fitting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
6.2 Regularisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
6.3 Common Deconvolution Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
6.3.1 Wiener Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
6.3.2 Tikhonov Regularised Deconvolution . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
6.3.3 Richardson Lucy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
6.3.4 Others . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
II Algorithms 53
7 Model Based Evaluation of SMI and 4Pi Data 55
7.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
7.2 Fit Algorithm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55CONTENTS ix
7.2.1 Fit to the Axial Proflle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
7.2.2 Lateral Gaussian Fit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
7.3 Object Identiflcation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
7.4 Implementation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
7.5 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
7.6 Automation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.7 Adaptation to 4Pi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.7.1 4Pi Model Function . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.7.2 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
8 4Pi Deconvolution With a Variable Phase 67
8.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
8.2 The Phase Shifted 4Pi PSF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
8.3 Phase Estimation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
8.4 Deconvolution Algorithm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
8.4.1 Deconvolution of Simulated Data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
8.4.2 Reconstruction of Biological Images . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
8.4.3 Performance of the Algorithm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
III Experimental 81
9 Reflnements to SMI Hardware 83
9.1 Black and White Camera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
9.1.1 Single Molecule Sensitivity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
9.2 Shutters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
9.3 568nm Excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
9.4 Transmitted Light Illumination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
9.4.1 Contrast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
9.5 Minor Changes to Setup and Adjustment Procedure . . . . . . . . . . . . . 87
9.5.1 Switch to Cube Beamsplitter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
9.5.2 Introductionof IrisDiaphragmsBetweenBeam Expander and Inter-
ferometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
9.5.3 Removing all Equipment with Fans from the Optical Table . . . . . 87
9.5.4 Moving from Fibre to Free Space Laser Coupling . . . . . . . . . . 88
9.5.5 Shifting the Lasers to a Separate Optical Table . . . . . . . . . . . 88
10 Bead Measurements 91
10.1 Reproducibility . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
10.2 Correction for Phase and Focal Plane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
10.2.1 Wavefront Tilt and Curvature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
10.2.2 Focal Plane Tilt and Curvature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101x CONTENTS
11 Replication Foci 103
11.1 GFP-PCNA labelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
11.2 with antibody ampliflcation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
11.3 Labelling through BrdU incorporation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
11.4 Comparison of Labelling Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
11.5 Cell to Cell Variability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
11.6 Outlook . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
11.6.1 Multi-colour Labelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
11.6.2 4Pi Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
12 Virtual SMI Microscopy of Gene Regions 115
12.1 Numerical Models for Chromatin Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
12.1.1 Polymer Basics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
12.1.2 Segmented Chain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
12.1.3 Worm Like . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
12.1.4 Odenheimer Model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
12.1.5 Denatured 30nm Fibre Model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
12.1.6 Wormlike Chain With Extra Compaction . . . . . . . . . . . . . . . 118
12.2 Image Generation and Evaluation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
12.3 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
12.3.1 Odenheimer Model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
12.3.2 Efiect of Labelling E–ciency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
12.3.3 200kbp 30nm Fibre - Wormlike Chain . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
12.3.4 30nm Fibre - We With Extra Compaction . . . 125
12.3.5 Comparison of Compact and Normal Wormlike Chain . . . . . . . . 125
12.3.6 Efiect of ‘Denaturation’ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
12.4 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
13 Inner Kinetochore Proteins 129
13.1 CENP Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
13.2 Size/Form Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
13.2.1 GFP, mRFP double labelling of CENP-A . . . . . . . . . . . . . . . 130
13.3 Simulation of 300nm disc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
13.4 Distance Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
14 Evaluation of Confocal and Widefleld Images 137
14.1 Lateral Size Estimates Using the Gaussian Fit . . . . . . . . . . . . . . . . 137
14.1.1 How to Correct Lateral Size Measurements . . . . . . . . . . . . . . 137
14.1.2 Relationship Between ¾ and Size . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
14.1.3 How Accurate is our Size Estimate? . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
14.1.4 Testing and Calibration on Beads Measurements . . . . . . . . . . . 139
14.1.5 Application to Biological Measurements . . . . . . . . . . . . . . . 140
14.2 Ten Point Model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

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