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Quantitative analysis of the early steps of virus host cell interaction of human immunodeficiency virus type 1 and hepatitis C virus [Elektronische Ressource] / presented by Manon Eckhardt

De
155 pages
DissertationsubmittedtotheCombinedFacultiesfortheNaturalSciencesandforMathematicsoftheRupertoCarolaUniversityofHeidelberg,GermanyforthedegreeofDoctorofNaturalSciencespresentedbyDipl.Biochem.ManonEckhardtborninFrankfurtamMain,GermanyOralexamination:May12,2010 Quantitative analysis of the early steps of virus host cell interaction of human immunodeficiency virus type 1 and hepatitis C virus Referees:Prof.Dr.HansGeorgKräusslichProf.Dr.RalfBartenschlager SummarySummary Virusesareobligatoryintracellularpathogens;henceanessentialstepoftheirreplicationcycleistheentryintoahostcell.Envelopedviruseslikethehumanimmunodeficiencyvirustype1 (HIV1) andthehepatitis C virus (HCV) enter cells byfusion with cellularmembranes. Thecurrentknowledgeofthisprocessreliesmostlyonbulkmeasurements,whichoftencomprisetheoutcome of several distinct replication steps in a nonsynchronized manner. The recentdevelopmentofnovelquantitativeapproacheshasopenedthedoorfordeeperunderstandingoftheprocessbyanalysesonasinglecellandsingleparticlelevel.Fluorescentlylabelledvirusesallowstudyingsinglestepsintheinteractionofindividualvirions with the host cell.
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Dissertation
submittedtothe
CombinedFacultiesfortheNaturalSciencesandforMathematics
oftheRupertoCarolaUniversityofHeidelberg,Germany
forthedegreeof
DoctorofNaturalSciences













presentedby
Dipl.Biochem.ManonEckhardt
borninFrankfurtamMain,Germany

Oralexamination:May12,2010










Quantitative analysis of the early steps of virus
host cell interaction of
human immunodeficiency virus type 1
and hepatitis C virus









Referees:
Prof.Dr.HansGeorgKräusslich
Prof.Dr.RalfBartenschlager

Summary
Summary
Virusesareobligatoryintracellularpathogens;henceanessentialstepoftheirreplication
cycleistheentryintoahostcell.Envelopedviruseslikethehumanimmunodeficiencyvirustype
1 (HIV1) andthehepatitis C virus (HCV) enter cells byfusion with cellularmembranes. The
currentknowledgeofthisprocessreliesmostlyonbulkmeasurements,whichoftencomprisethe
outcome of several distinct replication steps in a nonsynchronized manner. The recent
developmentofnovelquantitativeapproacheshasopenedthedoorfordeeperunderstandingof
theprocessbyanalysesonasinglecellandsingleparticlelevel.
Fluorescentlylabelledvirusesallowstudyingsinglestepsintheinteractionofindividual
virions with the host cell. A strategy for labelling HIV1 with organic dyes using the recently
describedSNAPtagwasestablishedandevaluatedinthisthesis.IntroductionoftheSNAPtag
didnotsignificantlyinterferewithvirusentryandinfectivityandallowedspecificlabellingofthe
Gag structural polyprotein in the context of virions and virus producing cells. Combining
fluorescentlylabelledHIV1withtheHCVpseudoparticlesystem(HCVpp)allowedtheanalysis
ofvirionattachmentandentrydependentontheenvelopeproteinofHCVonasingleparticle
level.Inaddition,the LactamasevirionfusionassaywasadaptedtoandoptimizedforHCVpp,
allowingthedetectionofviruscellfusion.Thedependencyofvirusparticlebinding,endocytic
uptake and fusion on various stimulating and inhibiting agents was investigated. The virus
bindingassaydevelopedforHCVppwassubsequentlyadaptedtoHIV1andrevealedcelltype
specific kinetics of virion attachment. Interestingly, the expression level of the cellular virion
tetheringfactorCD317wasshowntohavenoeffectonexogenousvirusbinding.
Themainpartofthisthesisaimedattheacquisitionandanalysisofquantitativemulti
parameterdataofHIV1entry.BesidesthereceptorCD4,HIV1entrydependsonthepresence
ofeitheroneofthetwomajorcoreceptors,CXCR4orCCR5.Theabilityofavirusvarianttouse
acoreceptordefinesthetropismofthevirusandisatleastinpartdeterminedbythesequenceof
the third variable loop (V3loop) of the viral envelope protein (Env). In summary, HIV entry
efficiencyisdeterminedbyacomplexinterplaybetweenEnvsequence,receptorandcoreceptor
densities.Adeeperinsightintotheinterdependenciesofthesecriticalparametersprovidesabasis
fortheunderstandingofthemechanismofactionofHIVentryinhibitorsaswellasofpathways
of resistance development against these compounds. Mathematical models describing the
interdependencieswillalsoaidintherefinementofalgorithmsforthegenotypicpredictionofco
receptortropism,whichisessentialfortheuseofcoreceptorantagonistsinantiretroviraltherapy.
Here,experimentalsystemsweredevelopedwhichallowacquisitionofdetailedquantitativedata
ontheinterdependenciesbetweentheseparametersasabasisforamathematicalmodelofthe
HIV1 entry process. This comprised the selection and characterization of suitable model cell
i
bSummary
linesandexperimentalconditions,thegenerationandcharacterizationofdefinedisogenicvirus
variantsandtheestablishmentandcalibrationofvirologicalassaysystems.Multivariantdatasets
were acquired under standard conditions and algorithms for multivariant data analysis which
havebeendevelopedincollaborationwithbioinformaticianswereevaluated.Acomprehensive
datasetwasobtainedbystudyingasubsetofvirusescarryingpatientderivedEnvvariantswhich
revealedquantitativedifferencesinreceptorandcoreceptordependencyaswellassensitivityto
prototype entry inhibitors beyond the overall results of common phenotyping/genotyping
methods.

iiZusammenfassung
Zusammenfassung
Viren sind obligatorische Zellparasiten; der Eintritt in die Wirtszelle stellt daher einen
essentiellen Schritt im Replikationszyklus jedes Virus dar. Umhüllte Viren wie das humane
ImmundefizienzvirusTyp1(HIV1)unddasHepatitisCVirus(HCV)tretendurchFusionder
Virushülle mit einer zellulären Membran in die Wirtszelle ein. Bisherige Analysen des
Viruseintritts beruhen überwiegend auf Ensemblemessungen, in denen oft mehrere
aufeinanderfolgendeReplikationsschritteinnichtsynchronisiertenMessungenzusammengefasst
werden. Neuere Methoden erlauben jedoch die eingehende quantitative Analyse einzelner
ReplikationsschritteaufderEbeneeinzelnerZellenundPartikel.
Fluoreszenzmarkierte Viren ermöglichen es, die Interaktion einzelner Virionen mit der
Wirtszellezuvisualisieren.IndieserArbeitwurdeeineStrategiezurMarkierungvonHIVmit
synthetischen Fluoreszenzfarbstoffen durch Einführung des ‚SNAPtags‘ entwickelt und
evaluiert. Der SNAPtag beeinträchtigte die virale Eintrittseffizienz und Infektiösität nur
geringfügig und ermöglichte die spezifische Markierung von Viren und dem viralen
Strukturprotein invirusproduzierenden Zellen.Durch Kombination fluoreszenzmarkierter HIV
Partikel mit dem HCV PseudopartikelSystem (HCVpp) sowie durch Anpassung des
LactamaseFusionsassaysanHCVppkonnteneinzelneSchrittedesdurchdieHCVHüllproteine
vermittelten Eintrittsprozesses und deren Abhängigkeit von stimulierenden und inhibierenden
Faktorenuntersuchtwerden.DieAnwendungderzuvormitHCVppentwickeltenMethodezur
UntersuchungderVirusbindungaufHIV1zeigtezelltypspezifischeUnterschiedeinderKinetik
derVirusbindung.Weiterhinwurdegezeigt,dassdieMengedeszellulärenVirusbindungsfaktors
CD317anderZelloberflächekeineRollebeiderBindungexogenerVirenspielt.
Der Hauptteildieser Arbeit befasst sichmitder AufnahmeundAnalysemultivarianter
Daten zum Zelleintritt von HIV. Neben dem Rezeptor CD4 benötigt HIV einen der beiden
KorezeptorenCCR5oderCXCR4.DerTropismusfüreinenoderbeidedieserKorezeptorenwird
weitgehend von der Aminosäuresequenz in der 3. variablen Schleife (V3loop) des HIV
Hüllproteins (Env) bestimmt. Die Eintrittseffizienz des Virus wird von einem komplexen
Zusammenspiel zwischen EnvSequenz, Rezeptor und Korezeptordichte bestimmt. Eine
genauere quantitative Analyse dieser Abhängigkeiten ist die Grundlage für ein besseres
Verständnis der Wirkungsweise von Inhibitoren des HIV Eintritts sowie der Entwicklung von
ResistenzengegendiesePräparate.EinmathematischesModelldesEintrittsprozesseswirdauch
zurVerbesserungvonAlgorithmenzurVorhersagedesKorezeptorTropismusbeitragen,diefür
dentherapeutischenEinsatzvonKorezeptorAntagonistenessentiellist.IndieserArbeitwurden
experimentelle Systeme entwickelt, die die Erhebung detaillierter quantitativer Daten zur
AbhängigkeitderEintrittseffizienzundInhibitorsensitivitätvonRezeptorundKorezeptordichte
iii
bZusammenfassung
erlauben. Dies umfasste die Auswahl und Charakterisierung geeigneter ModellZellinien, die
HerstellungundCharakterisierungeinerAuswahlisogenerVirusvarianten,sowiedieEtablierung
und Kalibrierung virologischer Testsysteme. Diese Daten bilden die Grundlage zur Erstellung
mathematischerModelledesEintrittsprozesses.SystematischemultivarianteDatensätzewurden
aufgenommen und Algorithmen zur Datenanalyse wurden in Zusammenarbeit mit
Bioinformatikern evaluiert. Die Analyse eines umfassenden Datensatzes zur Eintrittseffizienz
von isogenen Viren mit aus Patientenisolaten gewonnenen viralen V3loop Sequenzen ergab
individuelle Eintrittsprofile der Virusvarianten, die durch bisher gebräuchliche Geno und
Phänotypisierungsmethodennichterfasstwerden.



ivTableofcontents
Table of contents
SUMMARY ....................................................................................................... I
ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................... III
TABLE OF CONTENTS ..................................................................................... V
1 INTRODUCTION..........................................................................................1
1.1 HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE 1 – HIV-1 ............................................2
1.1.1 HIV1replicationcycle.................................................................................................4
1.1.2 HIV1entrymechanism................................................................................................6
1.1.3 Coreceptortropismanditstesting ..............................................................................12
1.2 HEPATITIS C VIRUS – HCV ........................................................................... 17
1.2.1 HCVentrymechanism ...............................................................................................17
1.3 FLUORESCENTLY LABELLED VIRUSES AS A TOOL ................................................ 19
1.3.1 SNAPtagasasubstituteforfluorescentproteins .........................................................20
1.3.2 FluorescentlylabelledHIV1proteins..........................................................................21
1.4 AIM OF THE WORK...................................................................................... 22
2 MATERIALS AND METHODS ...................................................................... 23
2.1 MATERIALS AND INSTRUMENTS ..................................................................... 23
2.1.1 Buffersandreagents ...................................................................................................24
2.1.2 Primers......................................................................................................................26
2.1.3 Plasmids ....................................................................................................................27
2.1.4 Celllines....................................................................................................................28
2.1.5 Antibodies .................................................................................................................29
2.2 MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS.............................................................. 29
2.2.1 TransformationofbacteriaandDNAamplification .....................................................29
2.2.2 DNAdigestionandligation ........................................................................................30
2.2.3 DNAamplificationbypolymerasechainreaction(PCR) .............................................30
2.2.4 Cloningprocedures ....................................................................................................31
2.3 BIOCHEMICAL METHODS ............................................................................. 33
2.3.1 SDSPolyacrylamideGelElectrophoresis(SDSPAGE)andWesternBlot ....................33
vTableofcontents
2.3.2 QuantitativeWesternBlot ..........................................................................................33
2.3.3 DotBlot.....................................................................................................................34
2.3.4 EnzymeLinkedImmunosorbentAssay(p24ELISA)...................................................34
2.3.5 Productionofoxidizedlowdensitylipoproteins(oxLDL) ............................................34
2.4 CELL BIOLOGICAL METHODS........................................................................ 35
2.4.1 Cellculture ................................................................................................................35
2.4.2 Transfectionofcells....................................................................................................35
2.4.3 SNAPlabellingofcells...............................................................................................36
2.4.4 Electronmicroscopicanalysisofcellsamples...............................................................36
2.4.5 Flowcytometryofcells(FACS) ..................................................................................37
2.4.6 QuantitativeFACSmeasurementswithQuantiBRITE.................................................37
2.4.7 Immunofluorescencestainingofcells ..........................................................................37
2.4.8 Automatedfluorescencemicroscopy ...........................................................................38
2.5 VIROLOGICAL METHODS ............................................................................. 39
2.5.1 Particlepreparation ....................................................................................................39
2.5.2 VirusBindingAssay ...................................................................................................39
2.5.3 VirusUptakeAssay....................................................................................................40
2.5.4 βLactamaseVirionFusionAssay ...............................................................................40
2.5.5 Infectivityassay..........................................................................................................41
2.5.6 ReplicationkineticsofHIV1derivatives.....................................................................41
SNAP2.5.7 SNAPlabellingofHIV .........................................................................................41
2.5.8 Transductionofcells ..................................................................................................41
2.6 COMPUTATIONAL METHODS......................................................................... 42
2.6.1 SemiautomatedParticleCountingandColocalisationAnalysis ...................................42
2.6.2 Automatedcellsegmentationandsinglecellreadoutofmicroscopicdata ....................42
3 RESULTS ................................................................................................... 43
3.1 FLUORESCENTLY LABELLED VIRUSES TO STUDY VIRUS CELL INTERACTIONS ............. 43
3.1.1 SNAPtagasatooltostudyvirusrelease.....................................................................43
3.1.2 FluorescentlylabelledHCVpseudoparticlestodissectthestepsofvirusentry ...............56
3.1.3 FluorescentlylabelledHIV1derivatives......................................................................65
3.2 PATIENT- AND DRUG-SPECIFIC MODELS OF HIV-1 ENTRY..................................... 69
3.2.1 Experimentalsystemstocreatemultidimensionaldata.................................................69
3.2.2 TwosystemstomeasureentryefficiencyofHIV1 .......................................................75
3.2.3 Establishmentofsinglecellanalysesofentryefficiency................................................80
3.2.4 EffectoftheamountofvirusincorporatedEnvproteinonentryefficiency....................82
vi

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