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AVERTISSEMENT



Ce document est le fruit d’un long travail approuvé par le jury de
soutenance et mis à disposition de l’ensemble de la communauté
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LIENS




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INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE (INPL)
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires (ENSAIA)
Laboratoire des Sciences du Génie Chimique (LSGC)
Ecole Doctorale Sciences et Ingénierie Ressources Procédés Produits Environnement (RP2E)


THESE
Présentée pour obtenir le grade de


Docteur de l’Institut National Polytechnique de Lorraine
Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires


Par
Naziha BARBOUCHE


Sujet

Réponse biologique de cellules animales à des
contraintes hydrodynamiques :
simulation numérique, expérimentation et
modélisation en bioréacteurs de laboratoire


Soutenue publiquement le 13 Novembre 2008



Membres du jury

Rapporteurs : Alain LINE (Professeur à l’INSA, Toulouse)
Cécile LEGALLAIS (Directeur de Recherche CNRS à l’UTC, Compiègne)

Examinateurs : Karine LOUBIERE (Chargé de Recherche CNRS au GEPEA, Saint Nazaire)
Annie MARC (Directeur de Recherche CNRS au LSGC, Nancy)
Eric OLMOS (Maître de conférences à l’ENSAIA-INPL, Nancy)
Emmanuel GUEDON (Chargé de Recherche CNRS au LSGC, Nancy)
- 1 - Remerciements


Les travaux de cette thèse ont été réalisés au Laboratoire des Sciences du Génie Chimique de
Nancy, au sein du groupe « Génie des Procédés Biotechnologiques et Alimentaires ». Je
remercie Michel Sardin directeur du LSGC et tous les membres du laboratoire de m’y avoir
accueillie.

J’exprime ma profonde reconnaissance à mes directeurs de thèse Annie Marc, Eric Olmos et
Emmanuel Guédon pour leur encadrement et leur rigueur scientifique, ainsi que leur soutien
durant ces années de thèse.

Je voudrais sincèrement remercier Cécile Legallais, Karine Loubière et Alain Liné pour avoir
accepté de juger ce travail.

J’aimerais adresser toute ma gratitude envers Eric Olmos pour avoir contribué à ce sujet avec
ses travaux de simulations numérique, et pour sa grande implication dans ce projet.

Mes vifs remerciements sont adressés à Fabrice Blanchard et aux membres de l’atelier et du
service SEMI (Hakim Benhara, Mathieu Weber, Christian Blanchard, Pascal Beaurain et
Richard Lainé) pour toute l’aide et la patience dont ils ont fait preuve avec les montages
expérimentaux.

J’aimerais remercier tous les membres du GPBA pour leur bonne humeur ainsi que pour la
chaleureuse ambiance au labo (malgré le froid lorrain), en particulier, Isabelle Chevalot,
Frantz Fournier, Evelyne Ronat et Jean-Louis Goergen.

Un grand merci à mes fidèles compagnons de joie et de galères : Emma, Marie-Françoise,
Eric H. et Eric O., ainsi qu’à mes valeureux stagiaires Jean-Mathieu et Cécile.

Je voudrais également remercier les membres du LISBP, et plus spécialement, Carole Jouve et
Sandrine Alfénore, pour leur accueil et leur encouragement durant la période de rédaction.

Enfin, mes pensées vont à ma famille : Monia, Férid, Linda, Midou, Rached et Christiane,
ainsi qu’à Haythem, pour leur réconfort et leur inébranlable soutien durant les moments
difficiles de cette thèse.
- 4 - SOMMAIRE GENERAL






Introduction Générale............................................................................................................ 13


Chapitre I : Synthèse Bibliographique................................................................................. 21
A. Procédés de culture de cellules animales ......................................................................... 25
B. Effets biologiques des contraintes hydrodynamiques ...................................................... 41
C. Les effets des contraintes hydrodynamiques dans des systèmes à petite échelle............. 59
D. Les effets des contraintes hydrodynamiques en bioréacteurs .......................................... 66
Conclusion.............................................................................................................................. 101


Chapitre II : Matériel et Méthodes..................................................................................... 103
A. Culture des cellules ........................................................................................................ 107
B. Outils analytiques........................................................................................................... 113
C. Méthodes numériques et caractérisation hydrodynamique ............................................ 126


Chapitre III : Etude expérimentale et numérique de l’hydrodynamique de cytoculteurs
agités ...................................................................................................................................... 143
Introduction ............................................................................................................................ 147
A. Analyse expérimentale de l’hydrodynamique du réacteur............................................. 160
B. Simulation numérique par CFD ..................................................................................... 163
C. Calcul de l’énergie dissipée............................................................................................ 168
D. Distribution et historique des contraintes subies par les cellules dans les réacteurs...... 169
Conclusion.............................................................................................................................. 181

- 5 -
Chapitre IV : Etude de la réponse cellulaire à une intensification de l’agitation et
modélisation hydro-cinétique .............................................................................................. 185
Introduction ............................................................................................................................ 189
A. Nouvelle approche de l'étude des contraintes hydrodynamiques sur les cellules animales
basée sur les outils de CFD et les cinétiques de culture expérimentales................................ 191
B. Cinétiques de cultures en absence de tensio-actif .......................................................... 232
Conclusion.............................................................................................................................. 245


Chapitre V : Quantification expérimentale et numérique du transfert d’oxygène
surfacique et volumique....................................................................................................... 249
Introduction ............................................................................................................................ 253
A. Mesures expérimentale du transfert d’oxygène.............................................................. 266
B. Simulations numériques des interfaces gaz-liquides...................................................... 274
Conclusion.............................................................................................................................. 283


Chapitre VI : Conception, dimensionnement et caractérisation d’un réacteur perfusé de
type Couette / Taylor-Couette............................................................................................. 287
Introduction ............................................................................................................................ 291
A. Conception et dimensionnement du réacteur ................................................................. 292
B. Caractérisation de l’hydrodynamique du RCTC............................................................ 302
Conclusion.............................................................................................................................. 311


Conclusion Générale et Perspectives .................................................................................. 313


Références Bibliographiques............................................................................................... 323


- 6 - NOMENCLATURE


VARIABLES

-1
a Aire interfaciale spécifique m
2A Aire de la surface libre m
-1c Concentration de l’oxygène dans la phase liquide mol.L
-1
c* Concentration de saturation de l’oxygène dans la phase liquide mol.L
C Couple N.m
c Constante de mort cellulaire d
c Constante de lyse cellulaire l
C Constante L
C Constante V
d Diamètre d’une particule m p
D Diamètre du mobile d’agitation m
d Diamètre d’une cellule m c
K -1f Fréquence des tourbillons turbulents s
I -1
f Fréquence des tourbillons turbulents dans le domaine inertiel s
V -1f Fréquence des tourbillons turbulents dans le domaine visqueux s
5IVCD Intégrale de la densité des cellules viables (Integral of Viable 10 cell.h/ml
Cell Density)
5
ILCD Intégrale de la densité des cellules lysées (Integral of Lysed 10 cell.h/ml
Cell Density
5ITCD Intégrale de la densité des cellules totales (Integral of Total Cell 10 cell.h/ml
Density
2 -2
k Energie cinétique turbulente m .s
-1
k Vitesse spécifique de mort cellulaire (cellules bleues) h d
k -1k Vitesse spécifique de mort cellulaire dans le modèle cinétique h d
-1k Vitesse spécifique de lyse cellulaire h l
-1
k Coefficient de transfert de matière m.s L
-1k a Coefficient volumique de transfert d’oxygène s L
L Echelle intégrale de la turbulence m
L Longueur ou taille de tourbillon m e
- 7 - Echelle de Kolmogorov m l K
-1 N Vitesse d’agitation s
-1 -1
O Concentration en oxygène dissous g.L ; mol.L 2
* -1 -
O Concentration de saturation en oxygène dissous g.L ; mol.L 2
P Puissance mécanique W
P( ) Fonction de densité de probabilité de
3
P / V Dissipation de puissance par unité de volume W / m
Q Débit de perfusion du réacteur Couette ml/mn ; L/h p
Q Débit de recyclage du réacteur Couette ml/mn ; L/h r
5q Vitesse spécifique de production d’ammonium μmol/10 cell/h ammonia
5
q Vitesse spécifique de consommation de glucose μmol/10 cell/h glucose
5
q Vitesse spécifique de consommation de glutamine μmol/10 cell/h glutamine
5q μg/10 cell/h Vitesse spécifique de production de l’IFN- IFN
5q Vitesse spécifique de production de lactate μmol/10 cell/h lactate
5
q Vitesse spécifique de production μmol/10 cell/h p
-1 -6
Vitesse spécifique de consommation d’oxygène mol.s .10 cell q O2
5
q Vitesse spécifique de consommation de substrat μmol/10 cell/h s
r Position radiale M
5
r Vitesse de lyse cellulaire 10 cell/ml/h l
5
r Vitesse de décès cellulaire (formation de cellules bleues) 10 cell/ml/h d
-1 -1r Vitesse de consommation de l’oxygène g.ml .h O2
-1 -1r Vitesse de consommation du substrat g.ml .h s
5
r Vitesse de croissance cellulaire 10 cell/ml/h x
S Concentration en substrat g/L ; mol/L
T Echelle de temps intégrale s
T Echelle de temps Lagrangienne du fluide s L
t Temps de passage dans le tourbillon s cross
t « Temps de vie » du tourbillon s e
t Temps d’interaction s I
t Temps de réponse de la particule (cellule) s p
-1u Vitesse de liquide m.s
-1u Vitesse de la particule (cellule) m.s p
-1
u’ Fluctuation de vitesse m.s
- 8 -
gaa-1U Vitesse superficielle de gaz m.s g
-1
Moyenne de la vitesse verticale proximale de la surface m.s u z
-1
Racine de la moyenne du carré de la vitesse verticale m.s 2u' z
3
V Volume du réacteur m
-1
X Cellules mortes bleues (marquage au bleu trypan) cell.ml b
-1X Cellules mortes totales (X = X + X ) cell.ml d d b l
-1
X Cellules lysées cell.ml l
-1
X Densité cellulaire moyenne cell.ml m
-1X Cellules totales (X = X + X + X ) cell.ml t t v b l
-1
X Cellules viables cell.ml v
-1
X Densité maximale de cellules viables cell.ml v, max
u yf+ +y Variable pariétale adimensionnelle y =
Y Rendement en ammonium par rapport à la glutamine mole/mole amm/glut
5
Y Rendement en IFN par rapport aux cellules viables μg/10 cellules IFN/Xv
Y Rendement en lactate par rapport au glucose mole/mole lact/gluc
-11Y X/gluc Rendement en cellules par rapport au glucose 10 cell/mole
-11Y X/glut Rendement en cellules par rapport à la glutamine 10 cell/mole
z Position axiale m


VARIABLES GRECQUES

Exposant fractal
Exposant fractal critique c
2 -3 -1 Taux de dissipation de l’énergie cinétique turbulente m .s , W.kg
-1& Gradient de vitesse s
Viscosité dynamique du liquide Pa.s
-1μ Vitesse spécifique de croissance apparente h app
-1
μ Vitesse spécifique de croissance réelle h real
2 -1 Viscosité cinématique du liquide m .s
- 9 -
maaengn