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UNIVERSITÉ BORDEAUX 2
École doctorale de Bordeaux

THÈSE
Pour l’obtention du diplôme de
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 – VICTOR SEGALEN
Mention Sciences, Technologies, Santé
Option Biologie Cellulaire et Physiopathologie

Présentée et soutenue publiquement
Le 25 Novembre 2009 à 14h30
Par
Marie BILLAUD
Née le 11 Février 1983 à Cholet (49)

RÔLE DES JONCTIONS COMMUNICANTES DANS LA
PAROI ARTÉRIELLE PULMONAIRE :
IMPLICATIONS EN PHYSIOPATHOLOGIE


Membres du Jury
Mme Joëlle AMÉDÉE Directeur de recherche INSERM, Bordeaux Président
Mme Chantal BOULANGER Directeur de recherche INSERM, Paris V Rapporteur
M. Laurent CRONIER Maître de conférence, Poitiers Rapporteur
Mme Elisabeth GENOT Directeur de recherche INSERM, Bordeaux Examinateur
M. Anh-Tuan DINH-XUAN Professeur des Universités-Praticien Hospitalier, Paris V
Melle Christelle GUIBERT Chargée de recherche INSERM, Bordeaux Directeur de Thèse SOMMAIRE
2SOMMAIRE........................................................................................................................2
REMERCIEMENTS ............................................................................................................8
LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS ...................................................13
LISTE DES FIGURES ......................................................................................................16 TABLEAUX...................................................................................................20
ABREVIATIONS ..............................................................................................................22
AVANT-PROPOS.............................................................................................................26
INTRODUCTION30
LA CIRCULATION PULMONAIRE.........................................................................................31
1. Généralités ...................................................................................................................31
2. Organisation et anatomie..............................................................................................32
3. Morphologie..................................................................................................................33
4. Mécanisme de contraction des cellules musculaires lisses..........................................34
L’HYPERTENSION ARTERIELLE PULMONAIRE .....................................................................37
1. généralités ....................................................................................................................37
2. Classification.................................................................................................................38
3. HTAP idiopathique, héréditaire et associée (groupe 1)................................................40
3.1. Données cliniques ................................................................................................................40
3.2. Modèle animal : le rat monocrotaline (MCT) ........................................................................41
4. HTAP hypoxique (groupe 3) .........................................................................................43
4.1. Données cliniques..43
4.2. Modèle animal : le rat hypoxique chronique (HC) ................................................................44
SEROTONINE ET HYPERTENSION ARTERIELLE PULMONAIRE................................................46
1. Sources de sérotonine..................................................................................................46
2. Les récepteurs à la sérotonine .....................................................................................47
3. Le transporteur de la sérotonine...................................................................................49
4. Sérotonine et circulation pulmonaire ............................................................................50
4.1. Sérotonine et circulation pulmonaire saine ..........................................................................51
4.2. 5-HT et HTAP idiopathique, héréditaire et associée (groupe 1) ..........................................52
4.3. P hypoxique (groupe 3)....................................................................................52
LES JONCTIONS COMMUNICANTES55
1. Structure des jonctions communicantes.......................................................................55
1.1. Découverte des jonctions communicantes...........................................................................55
1.2. Découverte de la protéine unitaire : la connexine................................................................56
31.3. Connexines : sous-unité protéique.......................................................................................57
1.4. Cycle de vie des connexines................................................................................................58
2. Propriétés physiologiques.............................................................................................61
3. Régulation de la communication intercellulaire ............................................................64
3.1. Les phosphorylations............................................................................................................64
3.2. Autres modes de régulation .................................................................................................65
4. Méthodes d’étude des jonctions communicantes.........................................................66
4.1. Outils pharmacologiques......................................................................................................66
4.2. Diffusion de traceurs.............................................................................................................68
4.3. Electrophysiologie ................................................................................................................70
4.4. Modèles animaux .................................................................................................................71
5. Les jonctions communicantes dans le système cardiovasculaire.................................72
5.1. Les jonctions communicantes dans le coeur .......................................................................72
5.2. Les jonctions coantes dans les vaisseaux...............................................................73
5.3. Jonctions communicantes et pathologies cardiovasculaires................................................75
5.4. Jonctions communicantes et circulation pulmonaire............................................................77
LES ESPECES REACTIVES DERIVEES DE L’OXYGENE (ROS)................................................78
1. Définition.......................................................................................................................78
2. Sources de ROS...........................................................................................................79
2.1. NADPH oxydase...................................................................................................................80
2.2. Mitochondrie.........................................................................................................................81
2.3. NO synthase (NOS) découplée............................................................................................83
2.4. Autres oxydases...................................................................................................................84
3. Systèmes endogènes de défense contre les ROS.......................................................84
3.1. Le monoxyde d’azote ...........................................................................................................84
3.2. Tétrahydrobioptérine.85
3.3. L’acide ascorbique (Vitamine C) et l’α-tocophérol (Vitamine E) ..........................................85
3.4. Les systèmes enzymatiques ................................................................................................85
4. Rôles physiologiques et physiopathologiques..............................................................87
4.1. Rôles physiologiques............................................................................................................87
4.2. Stress oxydant......................................................................................................................88
4.3. ROS et pathologies vasculaires ...........................................................................................89
5. ROS et circulation pulmonaire......................................................................................90
5.1. ROS et HTAP idiopathique, familiale et associée (groupe 1) ..............................................90
5.2. P hypoxique (groupe 3)....................................................................................91
6. ROS, 5-HT et circulation pulmonaire............................................................................93
MATERIELS ET METHODES ..........................................................................................94
MATERIEL BIOLOGIQUE...................................................................................................95
41. Animaux........................................................................................................................95
1.1. Groupe contrôle....................................................................................................................95
1.2. Modèles animaux d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP)..........................................95
2. Artère pulmonaire de rat...............................................................................................98
3. Cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires......................................................99
3.1. Dissociation cellulaire...........................................................................................................99
3.2. Culture cellulaire...................................................................................................................99
3.3. Vérification du phénotype musculaire lisse des cellules ....................................................100
MESURE SIMULTANEE DU CALCIUM ET DE LA CONTRACTION .............................................102
1. Dispositif expérimental................................................................................................102
1.1. La sonde calcique...............................................................................................................102
1.2. Artériographie.....................................................................................................................104
1.3. Charge des vaisseaux105
1.4. Vidéomicroscopie ...............................................................................................................106
1.5. Analyse des données .........................................................................................................107
2. Protocole expérimental...............................................................................................107
2.1. Mesure simultanée du calcium et de la contraction en réponse à la 5-HT ........................107
2.2. Inhibition des jonctions communicantes.............................................................................108
MESURE DE LA CONTRACTION ISOMETRIQUE ..................................................................110
1. Dispositif expérimental................................................................................................110
2. Protocole expérimental111
RT-PCR.....................................................................................................................112
1. Extraction d’ARN ........................................................................................................112
2. Reverse Transcription (RT) ........................................................................................112
3. Polymerase Chain Reaction (PCR) en temps réel .....................................................112
4. Analyse des résultats..................................................................................................114
WESTERN BLOT...........................................................................................................115
1. Extraction des protéines .............................................................................................115
2. Western Blot ...............................................................................................................115
IMMUNOFLUORESCENCE...............................................................................................117
COMMUNICATION MYOENDOTHELIALE ............................................................................118
RESONANCE PARAMAGNETIQUE DES ELECTRONS (RPE).................................................119
1. Principe.......................................................................................................................119
1.1. Rappels de physique quantique.........................................................................................119
1.2. Effet Zeeman......................................................................................................................119
1.3. Condition de résonance .....................................................................................................120
2. Utilisation de piégeur de spin (spin trap) ....................................................................121
53. Utilisation de sonde (« spin probe ») ..........................................................................122
4. Dispositif expérimental................................................................................................122
4.1. Appareil ..............................................................................................................................122
4.2. Spectres d’absorption.........................................................................................................124
5. Protocole.....................................................................................................................126
5.1. Mesure de l’anion superoxyde ...........................................................................................126
5.2. Mesure du NO ....................................................................................................................126
6. Analyse des résultats..................................................................................................127
MESURE DU GMPC......................................................................................................129
ANALYSE STATISTIQUE DES RESULTATS .........................................................................131
RESULTATS..................................................................................................................132
ETUDES DES JONCTIONS COMMUNICANTES DANS LA CIRCULATION PULMONAIRE SAINE.......133
1. Étude chez le rat.........................................................................................................133
2. Étude chez la souris ...................................................................................................134
3. Etude sur des CML en culture ....................................................................................136
4. Conclusion138
ETUDES DES JONCTIONS COMMUNICANTES DANS LA CIRCULATION PULMONAIRE
PATHOLOGIQUE ...........................................................................................................139
1. Profil d’expression des connexines dans la circulation pulmonaire pathologique ......139
1.1. Etude de l’expression des Cx 37, 40 et 43.........................................................................139
1.2. Etude de la localisation des Cx 37, 40 et 43 ......................................................................141
2. Rôle des jonctions communicantes dans la réponse à la 5-HT..................................143
2.1. Réactivité à la 5-HT des AIP1 de rats contrôles, HC et MCT ............................................143
2.2. Rôle des jonctions communicantes dans la réactivité à la 5-HT des AIP1 de rats
contrôles, HC et MCT ..........................................................................................................144
3. Rôle des jonctions communicantes dans la réactivité à l’endothéline-1.....................146
3.1. Réactivité à l’endothéline-1 des AIP1 de rats contrôles, HC et MCT.................................146
3.2. Rôle des jonctions communicantes dans la réactivité à l’ET-1 des AIP1 de rats contrôles,
HC et MCT...........................................................................................................................148
4. Rôle des jonctions communicantes dans la réactivité à la phényléphrine..................149
4.1. Réactivité à la phényléphrine des AIP1 de rats contrôles, HC et MCT..............................149
4.2. Rôle des jonctions communicantes dans la réactivité à la phényléphrine des AIP1 de rats
contrôles et HC....................................................................................................................151
5. Rôle des jonctions communicantes dans la réactivité à des solutions
hyperpotassiques........................................................................................................152
5.1. Réactivité à des solutions hyperpotassiques des AIP1 de rats contrôles, HC et MCT......152
65.2. Rôle des jonctions communicantes dans la réactivité à des solutions hyperpotassiques
des AIP1 de rats contrôles, HC et MCT ..............................................................................154
6. Conclusion..................................................................................................................156
DISCUSSION - PERSPECTIVES...................................................................................158
ETUDE DES JONCTIONS COMMUNICANTES DANS LA CIRCULATION PULMONAIRE SAINE.........159
1. L’anion superoxyde dans la réponse à la 5-HT des AIP.............................................159
2. Les jonctions communicantes dans la réponse à la 5-HT des AIP.............................162
3. Expression des connexines dans les CML d’AIP en culture.......................................163
4. Etude chez la souris ...................................................................................................164
ETUDE DES JONCTIONS COMMUNICANTES DANS LA CIRCULATION PULMONAIRE
PATHOLOGIQUE ...........................................................................................................165
1. Profil d’expression des connexines dans l’HTAP .......................................................165
2. Réactivité des AIP saines et pathologiques aux différents agonistes.........................166
2.1. Réactivité vasculaire à la 5-HT...........................................................................................166
2.2. Réacculaire à l’ET-1 .............................................................................................166
2.3. Réactivité vasculaire à des solutions hyperpotassiques....................................................166
2.4. Réactivité vasculaire à la phényléphrine............................................................................167
3. Rôle des jonctions communicantes dans la réactivité des AIP saines et
pathologiques .............................................................................................................167
3.1. Réactivité vasculaire à la 5-HT167
3.2. Réacculaire à l’ET-1168
3.3. Réactivité vasculaire à des solutions hyperpotassiques....................................................168
3.4. Réactivité vasculaire à la phényléphrine............................................................................168
CONCLUSION GENERALE...........................................................................................170
BIBLIOGRAPHIE ...........................................................................................................173
7
REMERCIEMENTS S
8Mademoiselle le Docteur Christelle Guibert
Je te remercie sincèrement pour tes conseils, ta patience, et tous ces moments passés
à travailler ensemble depuis 4 ans. Toujours disponible lorsque je frappais à ta porte, tu m’as
encadrée et guidée tout au long de ce travail. Tu m’as permis de mener à bien cette thèse, et tu
m’as donné l’opportunité de traverser l’Atlantique pour assurer mon avenir professionnel. Je te
suis profondément reconnaissante pour ton soutien, et espère pouvoir poursuivre ce travail
avec toi à l’avenir.

Monsieur le Professeur Roger Marthan
Je vous remercie de m’avoir accueillie au sein de votre laboratoire INSERM U885. Je
tiens à vous exprimer toute ma reconnaissance pour vos conseils, votre disponibilité et votre
confiance.

Monsieur le Professeur Jean-Pierre Savineau
Je tiens à vous remercier de m’avoir accueillie au sein de l’équipe vasculaire pulmonaire
du laboratoire. Vos conseils et votre rigueur ont contribué à la réalisation de ce travail.

Aux Docteurs Chantal Boulanger et Laurent Cronier
Je vous suis reconnaissante d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail de
thèse.

Madame le Docteur Joëlle Amédée
Je vous remercie sincèrement d’avoir accepté de présider ce jury de thèse. Je vous
remercie également de m’avoir initiée au monde fabuleux des jonctions communicantes il y a
plus de 4 ans !

Madame le Docteur Elisabeth Genot
Je te remercie d’avoir accepté de participer au jury de cette thèse. Je tiens également à
te remercier pour tes précieux conseils et ton enthousiasme dans la recherche scientifique.
9
Monsieur le Professeur Anh-Tuan Dinh-Xuan
Je vous suis sincèrement reconnaissante d’avoir accepté d’être présent dans ce jury de
thèse.
Aux Docteurs Carmen Martinez et Ramaroson Andriantsitohaina
Je vous remercie sincèrement de m’avoir accueillie au sein de votre laboratoire à Angers
pour me former à la RPE. Vos précieux conseils lors du comité de suivi de thèse m’ont permis
d’avancer dans mon projet.
Au Docteur Andrei Kleschyov
Je vous suis sincèrement reconnaissante pour vos précieux conseils en RPE.
Au Vascular Smooth Muscle Group (VSMG)
Merci aux Docteurs Thomas Ducret et Eric Dumas De La Roque, au Professeur Jean-
François Quignard, à Madame Huguette Crevel, et à tous les étudiants passés, présents et à
venir, pour les discussions scientifiques lors des VSMG meetings.
A toute l’équipe « pharma »
Merci au Professeur Bernard Muller, aux Docteurs Véronique Freund-Michel, Mathilde
Dubois, Arnaud Courtois, Isabelle Baudrimont et à Madame Martine Lacayrerie pour votre
attention, vos conseils, votre amitié et pour m’avoir aidée expérimentalement.
A Pierre Téchoueyres et Armelle Desveaux
Pour votre sourire, votre bonne humeur, et votre savoir faire !!
A Madame Vincendeau
Je vous remercie d’avoir relu attentivement mon manuscrit, et d’y avoir débusqué toutes
les coquilles, tel Maitre Capello !
Merci à toute l’équipe de l’unité INSERM U885.

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