Rôle des protéines de choc thermique HSP90 et HSP70 dans la différenciation macrophagique, Role of heat shock protein HSP90 and HSP70 in macrophagic differentiation

David Lanneau

Description

Sous la direction de Carmen Garrido
Thèse soutenue le 21 mai 2010: Dijon
La synthèse des protéines de choc thermique (HSPs) est un moyen de défense développé par la cellule pour faire face aux diverses agressions auxquelles elle peut être soumise. En tant que chaperons, les HSPs participent aux mouvements intracellulaires des protéines, préviennent l'agrégation des protéines altérées, éliminent les protéines anormales et contribuent à la conformation correcte des peptides nouvellement synthétisées. Mon équipe d’accueil s’intéresse aux rôles des HSPs dans des processus cellulaires tels que l’apoptose et la différenciation cellulaire. Le but de mon travail de thèse consiste à étudier le rôle des protéines de choc thermique HSP90 et HSP70 au cours de la différenciation des monocytes en macrophages. J’ai dans un premier temps étudié l’implication de HSP90 dans la différenciation macrophagique. c-IAP1 est un membre de la famille des protéines inhibitrices de l’apoptose impliqué dans la régulation de l’apoptose, dans le cycle cellulaire et dans la signalisation cellulaire. Nous avons précédemment montré que c-IAP1 migre du noyau vers le cytoplasme au cours de la différenciation cellulaire. Nous démontrons dans ce travail que c-IAP1 est une protéine cliente de la protéine de choc thermique HSP90β. Dans trois différents modèles de différenciation, ces protéines interagissent et migrent ensemble du noyau vers le cytoplasme au cours de la différenciation cellulaire. L’inhibition de HSP90 ou la déplétion spécifique de l’isoforme β par des siRNA conduisent à sa dégradation par le protéasome. La fonction de chaperon moléculaire de HSP90 envers c-IAP1 est spécifique de l’isoforme β car la déplétion de l’isoforme α n’a pas d’effets sur c-IAP1. De plus l’inhibition de HSP90 ou la déplétion de HSP90β bloquent la différenciation cellulaire tout comme la déplétion de c-IAP1 par siRNA. La deuxième partie de montre travail a consisté à étudier le rôle de HSP70 dans la différenciation macrophagique. Nous montrons que cette protéine est fortement induite après stimulation des cellules par le facteur de croissance M-CSF et que son inhibition bloque la différenciation des monocytes en macrophage. HSP70 interagit avec la protéine Spi-1/Pu.1, facteur de transcription clé de la différenciation macrophagique. L’expression de Spi-1/Pu.1 augmente également au cours de la différenciation macrophagique et ce de manière similaire à celle de HSP70. Ceci suggère l’implication des facteurs de transcription responsables de l’induction des HSPs, les Heat Shock Factor (HSF). L’étude du promoteur de Spi-1/Pu.1 a révélé la présence d’une séquence ressemblant fortement aux éléments de réponse classiques sur lesquels se fixe HSF1. HSF1 est capable de se fixer sur le promoteur de Spi-1/Pu.1 et l’inhibition de HSF1 bloque l’expression de Spi-1/Pu.1. HSF1 participe donc au contrôle de l’expression de Spi-1/Pu.1 lors de la différenciation macrophagique. HSP90 et HSP70 sont donc essentielles à la différenciation macrophagique. Comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans les voies de différenciation se révèle extrêmement important puisque des altérations des mécanismes de l’hématopoïèse sont retrouvées dans plusieurs types de leucémies (leucémies aiguës myéloblastiques et leucémies myélo-monocytaires chroniques). Connaître le rôle des HSPs dans la différenciation cellulaire permettrait donc de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
-Différenciation
-Macrophage
-Monocyte
-Hsps
-C-iap1
Heat shock proteins (HSPs) are molecular chaperones whose expression is increased after many different stresses. They have a protective function helping the cell to cope with lethal conditions. These proteins play an essential role as molecular chaperones by assisting the correct folding of nascent and stress-accumulated misfolded proteins and by preventing their aggregation. My team is interested in understanding the roles of HSPs in two physiological related processes: apoptosis and cell differentiation. The aim of my work is to study the functions of HSP90 and HSP70 in macrophagic differentiation. I first studied the role of HSP90 in macrophagic differentiation. We previously reported that cellular inhibitor of apoptosis protein-1 (c-IAP1), migrated from the nucleus to the surface of the Golgi apparatus in cells undergoing differentiation. c-IAP1 is a member of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family which has demonstrated functions in cell death, cell signaling and mitosis. Here, we show that c-IAP1 is a client protein of the stress protein HSP90β. In three distinct cellular models, the two proteins interact and migrate from the nucleus to the cytoplasm during the differentiation process through a leptomycin B-sensitive pathway. Inhibition of HSP90 proteins by small chemical molecules and specific depletion of HSP90isoform by siRNA both leads to c-IAP1 degradation by the proteasomal machinery. This chaperone function of HSP90 towards c-IAP1 is specific of its β isoform as specific depletion of HSP90α isoform does not affect c-IAP1 content. Chemical inhibition of HSP90 or siRNA-mediated depletion of HSP90both inhibit cell differentiation, which can be reproduced by siRNA-mediated depletion of c-IAP1. Altogether, these results suggest that HSP90prevents auto-ubiquitination and degradation of its client protein c-IAP1, whose depletion would be sufficient to inhibit cell differentiation. The second part of my work consisted in the study of the role of HSP70 in macrophagic differentiation. We used two models of differentiation: human peripheral monocytes exposed to M-CSF and THP1 cells induced to differentiate by TPA. We found that in both models, HSP70 expression was induced during differentiation. Interestingly, the expression of Spi-1/Pu.1, a transcription factor essential for monocytes to differentiate, was similarly induced. Upon differentiation, both proteins co-localized in the nucleus and associated. Inhibition or down regulation of HSP70 induced Spi-1/Pu.1 degradation and blocks the differentiation process, indicating that the necessity of Spi-1/Pu.1 to be chaperoned by HSP70 during differentiation. Since Spi-1/Pu.1 promoter has a HSE-like, we studied whether transcription factors responsible for HSPs induction, HSF, could be involved. We show that although HSF2 do not seem involved, HSF1 binds to Spi-1/Pu.1 promoter and its inhibition blocks Spi-1/Pu.1 expression and monocytes differentiation. So HSP90 and HSP70 are essentials for macrophagic differentiation. Understanding monocyte differentiation regulation is important since defects of the differentiation process can lead to the development of leukemias (acute myeloid leukemia, chronic myelomonocytic leukemia). A better understanding of the roles of HSPs may provide new therapeutic strategies for the treatment of these pathologies.
Source: http://www.theses.fr/2010DIJOS007/document

Sujets

• Différenciation

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 53
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

UNIVERSITE DE BOURGOGNE

U.F.R de Médecine



THÈSE


Pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Bourgogne


Discipline : Biochimie Cellulaire et Moléculaire



Par David LANNEAU


Le 21 mai 2010


Rôle des Protéines de Choc Thermique HSP90 et HSP70 dans
la différenciation macrophagique



Directeur de thèse : Dr. Carmen Garrido



Membres du Jury :

Dr. Valérie LALLEMAND-MEZGER Rapporteur
Dr. Geneviève COURTOIS Rapporteur
Dr. François MORLE Examinateur
Pr. Eric SOLARY Examinateur
Dr. Carmen GARRIDO Directeur de Thèse






UNIVERSITE DE BOURGOGNE

U.F.R de Médecine



THÈSE


Pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Bourgogne


Discipline : Biochimie Cellulaire et Moléculaire



Par David LANNEAU


Le 21 mai 2010


Rôle des Protéines de Choc Thermique HSP90 et HSP70 dans
la différenciation macrophagique



Directeur de thèse : Dr. Carmen Garrido



Membres du Jury :

Dr. Valérie LALLEMAND-MEZGER Rapporteur
Dr. Geneviève COURTOIS Rapporteur
Dr. François MORLE Examinateur
Pr. Eric SOLARY Examinateur
Dr. Carmen GARRIDO Directeur de Thèse

1






2




Résumé

La synthèse des protéines de choc thermique (HSPs) est un moyen de défense
développé par la cellule pour faire face aux diverses agressions auxquelles elle peut être
soumise. En tant que chaperons, les HSPs participent aux mouvements intracellulaires des
protéines, préviennent l'agrégation des protéines altérées, éliminent les protéines
anormales et contribuent à la conformation correcte des peptides nouvellement
synthétisées. Mon équipe d’accueil s’intéresse aux rôles des HSPs dans des processus
cellulaires tels que l’apoptose et la différenciation cellulaire. Le but de mon travail de thèse
consiste à étudier le rôle des protéines de choc thermique HSP90 et HSP70 au cours de la
différenciation des monocytes en macrophages.
J’ai dans un premier temps étudié l’implication de HSP90 dans la différenciation
macrophagique. c-IAP1 est un membre de la famille des protéines inhibitrices de l’apoptose
impliqué dans la régulation de l’apoptose, dans le cycle cellulaire et dans la signalisation
cellulaire. Nous avons précédemment montré que c-IAP1 migre du noyau vers le cytoplasme
au cours de la différenciation cellulaire. Nous démontrons dans ce travail que c-IAP1 est une
protéine cliente de la protéine de choc thermique HSP90β. Dans trois différents modèles de
différenciation, ces protéines interagissent et migrent ensemble du noyau vers le
cytoplasme au cours de la différenciation cellulaire. L’inhibition de HSP90 ou la déplétion
spécifique de l’isoforme β par des siRNA conduisent à sa dégradation par le protéasome. La
fonction de chaperon moléculaire de HSP90 envers c-IAP1 est spécifique de l’isoforme β car
la déplétion de l’isoforme α n’a pas d’effets sur c-IAP1. De plus l’inhibition de HSP90 ou la
déplétion de HSP90β bloquent la différenciation cellulaire tout comme la déplétion de c-
IAP1 par siRNA.
La deuxième partie de montre travail a consisté à étudier le rôle de HSP70 dans la
différenciation macrophagique. Nous montrons que cette protéine est fortement induite
après stimulation des cellules par le facteur de croissance M-CSF et que son inhibition
bloque la différenciation des monocytes en macrophage. HSP70 interagit avec la protéine
Spi-1/Pu.1, facteur de transcription clé de la différenciation macrophagique. L’expression de
Spi-1/Pu.1 augmente également au cours de la différenciation macrophagique et ce de
manière similaire à celle de HSP70. Ceci suggère l’implication des facteurs de transcription
responsables de l’induction des HSPs, les Heat Shock Factor (HSF). L’étude du promoteur de
Spi-1/Pu.1 a révélé la présence d’une séquence ressemblant fortement aux éléments de
réponse classiques sur lesquels se fixe HSF1. HSF1 est capable de se fixer sur le promoteur
de Spi-1/Pu.1 et l’inhibition de HSF1 bloque l’expression de Spi-1/Pu.1. HSF1 participe donc
au contrôle de l’expression de Spi-1/Pu.1 lors de la différenciation macrophagique.
HSP90 et HSP70 sont donc essentielles à la différenciation macrophagique.
Comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans les voies de différenciation se révèle
extrêmement important puisque des altérations des mécanismes de l’hématopoïèse sont
retrouvées dans plusieurs types de leucémies (leucémies aiguës myéloblastiques et
leucémies myélo-monocytaires chroniques). Connaître le rôle des HSPs dans la
différenciation cellulaire permettrait donc de développer de nouvelles stratégies
thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
3




Abstract
Heat shock proteins (HSPs) are molecular chaperones whose expression is increased
after many different stresses. They have a protective function helping the cell to cope with
lethal conditions. These proteins play an essential role as molecular chaperones by assisting
the correct folding of nascent and stress-accumulated misfolded proteins and by preventing
their aggregation. My team is interested in understanding the roles of HSPs in two
physiological related processes: apoptosis and cell differentiation. The aim of my work is to
study the functions of HSP90 and HSP70 in macrophagic differentiation.
I first studied the role of HSP90 in macrophagic differentiation. We previously
reported that cellular inhibitor of apoptosis protein-1 (c-IAP1), migrated from the nucleus to
the surface of the Golgi apparatus in cells undergoing differentiation. c-IAP1 is a member of
the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family which has demonstrated functions in cell
death, cell signaling and mitosis. Here, we show that c-IAP1 is a client protein of the stress
protein HSP90β. In three distinct cellular models, the two proteins interact and migrate from
the nucleus to the cytoplasm during the differentiation process through a leptomycin B-
sensitive pathway. Inhibition of HSP90 proteins by small chemical molecules and specific
depletion of HSP90  isoform by siRNA both leads to c-IAP1 degradation by the proteasomal
machinery. This chaperone function of HSP90 towards c-IAP1 is specific of its β isoform as
specific depletion of HSP90α isoform does not affect c-IAP1 content. Chemical inhibition of
HSP90 or siRNA-mediated depletion of HSP90  both inhibit cell differentiation, which can be
reproduced by siRNA-mediated depletion of c-IAP1. Altogether, these results suggest that
HSP90  prevents auto-ubiquitination and degradation of its client protein c-IAP1, whose
depletion would be sufficient to inhibit cell differentiation.
The second part of my work consisted in the study of the role of HSP70 in
macrophagic differentiation. We used two models of differentiation: human peripheral
monocytes exposed to M-CSF and THP1 cells induced to differentiate by TPA. We found that
in both models, HSP70 expression was induced during differentiation. Interestingly, the
expression of Spi-1/Pu.1, a transcription factor essential for monocytes to differentiate, was
similarly induced. Upon differentiation, both proteins co-localized in the nucleus and
associated. Inhibition or down regulation of HSP70 induced Spi-1/Pu.1 degradation and
blocks the differentiation process, indicating that the necessity of Spi-1/Pu.1 to be
chaperoned by HSP70 during differentiation. Since Spi-1/Pu.1 promoter has a HSE-like, we
studied whether transcription factors responsible for HSPs induction, HSF, could be involved.
We show that although HSF2 do not seem involved, HSF1 binds to Spi-1/Pu.1 promoter and
its inhibition blocks Spi-1/Pu.1 expression and monocytes differentiation.
So HSP90 and HSP70 are essentials for macrophagic differentiation. Understanding
monocyte differentiation regulation is important since defects of the differentiation process
can lead to the development of leukemias (acute myeloid leukemia, chronic myelomonocytic
leukemia). A better understanding of the roles of HSPs may provide new therapeutic
strategies for the treatment of these pathologies.

4
























En science, la phrase la plus exc