Role of BET-proteins in the function of rhadinoviral Orf73-proteins [Elektronische Ressource] / Daniel Pliquet

Daniel Pliquet

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2011
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Role of BET-Proteins in the Function of Rhadinoviral Orf73-Proteins


Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades

Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.

genehmigte Dissertation




von Dipl.-Biochem. Daniel Pliquet

geboren am 14.12.1977 in Pinneberg
















2011

Referent: Prof. Dr. Thomas F. Schulz
Institut für Virologie
Medizinische Hochschule Hannover


Koreferent: Prof. Dr. Edgar Maiss
Institut für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz
Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover


Tag der Promotion: 17.11.2010

























2Zusammenfassung

Das Kaposi Sarkom assoziierte Herpesvirus (KSHV) gehört zusammen mit dem murinen γ-
Herpesvirus 68 (MHV68) zur Gattung der Rhadinoviren in der Ordnung Herpesvirales. Beide Viren
persistieren im lymphatischen Gewebe und spielen eine Rolle bei der Entstehung lymphoproliferativer
Erkrankungen. Eines der wichtigsten Latenzproteine ist im offenen Leserahmen (orf) 73 kodiert, bei
KSHV wird das Protein auch als Latenz assoziiertes nukleäres Antigen 1 (LANA-1) bezeichnet. Beide
orf73 Proteine werden in der Latenzphase exprimiert und erfüllen verschiedene wichtige Funktionen
für das Virus. Eine dieser Funktionen ist die Interaktion mit zellulären BET Proteinen. In dieser Arbeit
wurde die molekulare Natur dieser Interaktion und deren Auswirkungen untersucht.
Es gelang uns, zwei zuvor in einem Peptid Interaktionsversuch identifizierte Bindungsstellen für BET
Proteine innerhalb des MHV68 orf73 Proteins zu bestätigen. Die Bindungsstellen wurden auf
verschiedene Weise mutiert, um den Einfluss der Bindungsstellen auf Funktionen des MHV68 orf73
Proteins zu untersuchen. Das Aminosäuremotiv KKLK in der C-terminalen BET Bindungsstelle ist
notwendig für die Interaktion des MHV68 orf73 Proteins mit den BET Proteinen Brd2 und Brd4.
Mutationen in diesem Motiv verursachen keine Veränderung bei der Bindung des MHV68 orf73
Proteins an mitotische Chromosomen, das schliesst eine Beteiligung von BET Proteinen bei der
Anheftung der viralen Genome an Chromosomen während der Mitose aus. Aber die Mutation des
Bindungsmotivs verringert die Fähigkeit des MHV68 orf73 Proteins, die Transkription von Cyclin
Promotoren zu aktivieren. Die Interaktion mit den BET Proteinen Brd2 und Brd4 spielt also eine Rolle
bei der Aktivierung von transkriptionellen Prozessen durch das MHV68 orf73 Protein, ist aber nicht
an der Persistenz des viralen Genoms in der Zelle beteiligt.
Das LANA-1 Protein von KSHV wurde in einem Yeast two Hybrid Interaktionsversuch mit einer
Bibliothek von Peptidaptameren verwendet. Es konnten drei Peptidaptamere identifiziert werden, die
mit dem C-terminalen Teil des LANA-1 Proteins von Aminosäure 1090 bis 1162 interagieren, der
auch die Region mit der höchsten Sequenzähnlichkeit zum MHV68 orf73 Protein und die
Bindungsstelle für die BET Proteine im MHV68 orf73 Protein beinhaltet. Die interagierenden
Peptidaptamere inhibierten sowohl die von LANA-1 verursachte Aktivierung des Cyclin E Promotors
als auch eines Promotors, der auf Serum ansprechende Sequenzen enthält. Eine generelle Inhibition
der Transkription wurde ausgeschlossen, da die interagierenden Peptidaptamere zwei virale
Promotoren nicht beeinflussten. Die Peptidaptamere veränderten die Aktivierung des LTR Promotor
von HIV durch das TAT Protein, welche durch Brd4 vermittelt wird, nicht.
Die Erkenntnisse dieser Arbeit betonen die wichtige Rolle der Interaktion von BET Proteinen mit
orf73 Proteinen für deren Funktion während des viralen Lebenszyklus.


3Summary

The Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) belongs, together with murine γ-herpesvirus 68
(MHV68), to the genus of Rhadinoviruses within the order of Herpesvirales. Both viruses persist in
lymphoid tissues and are involved in lymphoproliferative disease. A main factor for the latent
infection is encoded in open reading frame (orf) 73, the protein is termed latency-associated nuclear
antigen 1 (LANA-1) for KSHV. Both orf73 proteins are expressed during latency and fulfil several
important functions in the viral life cycle. One of the conserved functions is the interaction with
cellular BET proteins. In this thesis we investigated the molecular nature of the interaction of the
MHV68 orf73 protein with the BET proteins Brd2 and Brd4 and the consequences of this interaction.
We were able to verify two potential BET binding sites within the MHV68 orf73 protein, which were
identified by an in vitro peptide interaction assay. These BET binding sites were mutated in several
variants to adress the impact of the interaction with BET proteins on MHV68 orf73 functions. The
motif of the amino acids (aa) KKLK in the C-terminal BET binding site mediated interaction with the
two BET proteins Brd2 and Brd4. Mutation of this motif did not alter tethering of the MHV68 orf73
protein to mitotic chromosomes and therefore BET proteins are not involved in tethering of the
MHV68 viral genome to chromosomes during mitosis. However, the mutation of BET binding sites
impaired the induction of transcription from cyclin promotors by the MHV68 orf73. Therefore the
interaction with the BET proteins Brd2 and/or Brd4 is involved in transcriptional activation processes
of the MHV68 orf73, but not in viral genome maintenance.
The KSHV LANA-1 protein was subject of a yeast two hybrid screen with a library of peptide
aptamers. We identified three peptide aptamers, which bind to aa 1090-1162 of the LANA-1 protein,
which encompasses the region with the highest sequence similarity to the MHV68 orf73 protein and
the binding site for BET proteins. The interacting peptide aptamers were able to impair LANA-1
mediated activation of transcription from the cyclin E promotor and a serum reponse element
containing promotor, in contrast to a not interacting peptide aptamer or the empty expression vector.
This downregulation is not caused by a general inhibition of transcription, as the transcription from the
long terminal repeat promotor (LTR) of HIV and the immediate early promotor of human
cytomegalovirus (CMV) are not affected by the expression of any peptide aptamer. Also a general
inhibition of the positive effect of Brd4 in the P-TEFb complex can be excluded, since the induction of
the LTR promotor by the HIV transactivator of transcription (TAT) was not altered by any peptide
aptamer.
These findings indicate the importance of the interaction between BET proteins and the orf73 proteins
for their regular function during the viral life cycle.



4Schlagwörter:

Herpesviren, BET-Proteine, Zellzyklus


Keywords:

Herpesvirus, BET-Proteins, Cellcycle






























5Table of content:

Zusammenfassung 3
Summary 4
1. Introduction 10
1.1. The family of Herpesviridae 10
1.2. The subfamily of γ-Herpesviridae 12
1.2.1. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) 12
History of KSHV 12
Epidemiology of KSHV 13
Transmission of KSHV 14
KSHV and neoplastic disorders 15
KSHV lifecycle 17
Immune evasion by KSHV 20
1.2.2. Murine gammaherpesvirus 68 (MHV68) 25
1.3. Replication of Rhadinoviruses 28
1.4. Cell cycle and its alteration by Rhadinoviruses 33
1.4.1. Cell cycle regulation 34
Cyclins and cyclin dependent kinases (CDK) 34
The retinoblastoma protein (Rb) and progression to S phase 35
1.4.2. Cell cycle modification by Rhadinoviruses 37
Viral Cyclin 37
Latency-associated nuclear antigen 1 (LANA-1) 38
LANA-2/vIRF-3 38
Lytic proteins 39
1.5. Orf73 encoded proteins of Rhadinoviruses 40
1.5.1. Latency-associated nuclear antigen 1 of KSHV 40
1.5.2. The orf73 protein of MHV68 47
1.6. Bromodomain and extraterminal domain containing (BET) proteins 48
Bromodomain 49
Extraterminal (ET) domain 49
1.6.1. BET proteins in yeast and drosophila 50
Yeast Bdf-1 and Bdf-2 proteins 50
Drosophila female sterile homoetic (fsh) protein 51
1.6.2. Mammalian BET-proteins 51
6Brd3/OrfX 52
Brd6/BrdT 52
Brd2/RING3 53
Brd4/HUNK/MCAP 55
1.7. Objectives 58
2. Materials and Methods 59
2.1. Reagents 59
2.1.1. Antibodies 59
2.2. Vectors and Primers 61
2.2.1. Eukaryotic expression vectors 61
2.2.2. Prokaryotic expression vectors 66
2.2.3. Reporter vectors 68
2.2.4. Primers 70
2.2.5. Recombinant baculovirus 71
2.3. Cell culture methods for eukaryotic cells 71
2.3.1. Supplies used for propagation 71
2.3.2. Eukaryotic cell lines 71
2.3.3. Cell culture conditions 72
2.3.4. Cryopreservatio