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Análisis y caracterización de genes de Botrytis cinerea cuya
expresion se inducen in planta en la interacción
B. cinerea - tomate
David Benito Pescador
Centro Hispano Luso de Investigaciones Agrarias
Departamento de Microbiología y GenéticaCENTRO HISPANO LUSO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA
ÁREA DE GENÉTICA
Análisis y caracterización de genes de Botrytis cinerea cuya expresión
se induce in planta en la interacción B. cinerea - tomate
Memoria que presenta David Benito Pescador para optar al grado de Doctor
Salamanca, a 21 de Mayo de 2010D. ERNESTO PÉREZ BENITO, PROFESOR TITULAR DE GENÉTICA DEL ÁREA
DE GENÉTICA DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA
DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
Y
D. ARTURO PÉREZ ESLAVA, CATEDRÁTICO DE GENÉTICA DEL ÁREA DE
GENÉTICA DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA DE
LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
AUTORIZAN
La presentación y defensa de la Tesis Doctoral titulada: “Análisis y caracterización de
genes de Botrytis cinerea cuya expresión se induce in planta en la interacción B. cinerea
- tomate”, para optar al grado de Doctor por la Universidad de Salamanca, que ha sido
realizada por D. David Benito Pescador bajo nuestra dirección, en el Área de Genética del
Departamento de Microbiología y Genética.
En Salamanca, a 21 de Mayo de 2010
Fdo. Dr. D. Ernesto Pérez Benito Fdo. Dr. D. Arturo Pérez EslavaD. ERNESTO PÉREZ BENITO, PROFESOR TITULAR DE GENÉTICA DEL ÁREA
DE GENÉTICA DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA
DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
Y
D. ARTURO PÉREZ ESLAVA, CATEDRÁTICO DE GENÉTICA DEL ÁREA DE
GENÉTICA DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA DE
LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
CERTIFICAN
que D. David Benito Pescador ha realizado en el Área de Genética del Departamento de
Microbiología y Genética el trabajo titulado: “Análisis y caracterización de genes de Bo-
trytis cinerea cuya expresión se induce in planta en la interacción B. cinerea - tomate”, bajo
nuestra dirección para optar al grado de Doctor por la Universidad de Salamanca.
Y para que así conste, extendemos el presente certifcado en Salamanca, a 21 de Mayo de
2010
Fdo. Dr. D. Ernesto Pérez Benito Fdo. Dr. D. Arturo Pérez EslavaD. ÁNGEL DOMÍNGUEZ OLAVARRI, CATEDRÁTICO DE MICROBIOLOGÍA
Y DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA DE
LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
CERTIFICA
Que la memoria titulada: “Análisis y caracterización de genes de Botrytis cinerea cuya
expresión se induce in planta en la interacción B. cinerea - tomate”, presentada por D.
David Benito Pescador para optar al grado de Doctor por la Universidad de Salamanca,
ha sido realizada bajo la dirección de los doctores D. Ernesto Pérez Benito y D. Arturo
Pérez Eslava, en el Área de Genética del Departamento de Microbiología y Genética de la
Universidad de Salamanca.
Y para que así conste, extiendo el presente certifcado en Salamanca, a 21 de Mayo de
2010
Fdo. Dr. D. Ángel Domínguez OlavarriAgradecimientos
Cuando Tomas Alva Edison (1847-1931) inventó la bombilla, no le salió a la
primera, sino que realizó más de mil intentos, hasta el punto de que uno de los
discípulos que colaboraba con él en el taller le preguntó si no se desanimaba
ante tantos fracasos. A lo que Edison respondió:
"¿Fracasos? No sé de qué me hablas. En cada descubrimiento me enteré
de un motivo por el cual una bombilla no funcionaba. Ahora ya sé
mil maneras de no hacer una bombilla".
Gracias:
A mis padres, sin ellos ni existiría ni seria lo que soy. A ellos le debo este
trabajo y mucho más.
A mi hermana Jessica y al resto de mi familia por estar ahí cuando siem-
pre lo necesitaba.
A mis directores, Arturo que me dió la oportunidad de introducirme en
el apasionante mundo de la investigación y a Ernesto que me dirigió este
trabajo, y con su paciencia hacerme ver las cosas de una forma pausada y
meditada.
A toda la gente del Laboratorio de Genética, desde los “mayores” (Maribel, Che-
ma, Itu, Fernando...) hasta los estudiantes que pasaron fugazmente (Johanna, Mar-
ga...), sin olvidar a mis compañeros “genéticos” que tantas risas y alguna que otra pena
hemos pasado juntos (Raúl, Raulito, Monica, Caty, Elvira, Brisa, Norman, Juan Luis,
Choni, Jose Javier, Tais, Bea...).
A mi nueva familia científca del Servicio de Alergias (Félix, Ignacio y María) que
me han mostrado otro camino de la investigación y la oportunidad de ser parte
de su grupo. Así como a los nuevos compañeros “clínicos” que he encontrado en
esta nueva etapa (Arturo, Laura, Juana, Virginia, Marien, Fernando, David, Eva,
Marta, Maria Luisa...) y a todo el personal del Servicio de Alergias (Carmen, Elena,
Esther, Paco, Maite, MariAngeles, Juan, MariaJose...), por haberme acogido tan
bien y hacerme sentir tan querido.
A todos mis amigos, tanto los “de toda la vida” (Paco, Santi, Guille, Anxo, Dani,
Fernando, Jose, Lolo, Carlos, Boti, Pablo, Alex...) como a los “de la carrera” (Ro-
dri, Nacho, Diego, Sebas, Meri, Elena, Toni, Chuchi, Sara, Nuño, Esther, Eva...),
como a los que me he ido encontrando por el camino (Sergio, Javi, Marcos, Re-
beca, Beatriz, Claudia, Anxo, Javier...) y tantos otros que me dejo en el tintero.
Y en especial a Maria, Elvira y Chedex por su apoyo incondicional.
Y por último, pero no menos importante, a Javi por su ayuda
“gráfca y digital”.
Gracias,a todos vosotros por ser esas “chispas”
que me iluminaban cada vez que mis “bombillas”
no eran capaz de dar luz.
I“Llevas tanto tiempo en mi vida que no recuerdo nada más”
Ellen L. Ripley
3AlIen
IIIÍndice de matrias
Índice de matria s V
Índice de fguras XI
Símbolos y aeviatura s XIII
Resume n XV
Introducción 1
1. Hongos ftopatógenos 3
1.1. Tipos de hongos ftopatógenos
2. Interacción planta-patógeno 5
2.1. Respuesta de la planta
2.2.a. Respuesta de Hipersensibilidad
2.2.b. Resistencia Sistémica Adquirida
2.3. El proceso de la infección
2.3.a. Germinación de la espora y fase de penetración
2.3.b. Fase de crecimiento
2.2.c. Esporulación
3. Botrytis cinerea 9
3.1. Sistemática y descripción
3.2. Ciclo de vida
3.3. Variabilidad genética
3.4. Epidemiología y ciclo de la enfermedad
3.5. Rango de hospedadores y sintomatología
3.6. Estrategias de control
3.6.a. Control químico
3.6.b. Control biológico
3.6.c. Prácticas culturales
3.6.d. Mejora genética
4. Interacción B. cinerea - huésped 23
4.1. Mecanismos de patogenicidad en B. cinerea
4.1.a. Dispersión
VAnálisis y caracterización de genes de B. cinerea inducidos in planta
David Benito Pescador
4.1.b. Adhesión
4.1.c. Germinación
4.1.d. Penetración
4.1.e. Muerte celular
4.1.e.1. Metabolitos de bajo peso molecular
4.1.e.2. Choque oxidativo
4.1.e.3. Ácido oxálico
4.1.e.4. Proteínas tóxicas
4.2. La infección requiere de una participación activa del huésped
4.3. Evasión de los mecanismos de defensa de la planta
4.4. Mecanismos de señalización durante la infección
4.4.a. Ruta de señalización dependiente de AMPc
4.4.b. Ruta de señalización controlada por la MAP kinasa
2+4.4.c. Ruta de señalización dependiente de Ca /calmodulina
4.4.d. Ruta de señalización de las proteínas GTPasa s
4.5.e. Sensores y receptores
5. Estrategias experimentales para el estudio de los mecanismos moleculares de patoge-
nicidad en B. cinerea. 33
5.1. Análisis por inactivación génica en B. cinerea
5.1.a. Mutagénesis dirigida por disrupción génica
5.1.b. Mutagénesis dirigida por reemplazamiento génico
5.1.c. Mutagénesis aleatoria por inserciones de T-DN A
5.1.d. Silenciamiento génico por ARN de interferencia
5.2. Métodos indirectos de análisis de la función génica en B. cinerea
5.3. Análisis y caracterización funcional de genes expresados diferencialmente in planta.
5.3.a. Expresión diferencial mediante DDRT-PC R
5.3.b. Señales detectadas y genes expresados en la interacción B. cinerea-tomate
5.3.b.1. Fragmento ddB-2
5.3.b.2. Fragmento ddB-47
Ojetivo s 43
Matriales  Méto dos 47
6. Organismos 49
6.1. Plantas
VIÍndice de matrias
6.2. Hongos
6.3. Bacterias
6.4. Virus
7. Medios y condiciones de cultivo 51
7.1. Plantas
7.2. Hongos
7.2.a. Cultivo en medio líquido de B. cinerea
7.2.b. Cultivo en medio sólido de B. cinerea
7.3. Bacterias
7.4. Bacteriófagos
8. Manipulación de B. cinerea 55
8.1. Recolección de conidios de B. cinerea
8.2. Conservación de aislados
8.3. Obtención de cultivos monospóricos
9. Estudio del fenotipo en B. cinerea 57
9.1. Ensayos de crecimiento saprofítico
9.2. Ensayos de infección en planta
9.2.a. Caracterización ftopatológic a
9.2.b. Obtención de material infectado para la extracción de DNA y RNA
9.3. Estudios de microscopía
9.3.a. Microscopía óptica
9.3.b. Microscopía confocal
9.3.c. Tincione s
10. Herramientas y procedimientos moleculares 61
10.1. Extracción de ácidos nucleicos
10.1.a. DNA genómico de B. cinerea
10.1.a.1. Método estándar
10.1.a.2. Método rápido
10.1.b. ADN plasmídico
10.1.b.1. Minipreparación de ADN plasmídico mediante lisis alcalina
10.1.b.2. Preparación de grandes cantidades de ADN plasmídico
10.1.b.3. Utilización de un kit comercial para la purifcación de ADN plasmídic o
10.1.c. ADN de bacteriófagos
10.1.d. Extracción de ARN total de B. cinerea
10.2. Vectores de clonación
10.2.a. pGEM-T y PGEM-T eas y
10.2.b. pBlueScript II SK +/-
VII

Un pour Un
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