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Avances en la sistemática del género Micromonospora: estudio de cepas aisladas de la Rizosfera y Nódulos de Pisum sativum

De
391 pages
Colecciones : DMG. Tesis del Departamento de Microbiología y GenéticaTD. Ciencias biosanitarias
Fecha de publicación : 2010
[ES] En este trabajo se ha llevado a cabo el aislamiento de 272 cepas, 239 obtenidas a partir de nódulos fijadores de nitrógeno de plantas de Pisum sativum esterilizados en superficie y recogidos en siete localidades diferentes de Castilla y León y 33 a partir de la rizosfera de esas mismas plantas. De estas cepas se seleccionaron las 106 obtenidas en Cañizal y en Salamanca, 27 y 46 obtenidas de nódulos, y 21 y 12 obtenidas de rizosfera respectivamente, para realizar un análisis de la diversidad, comprobando la eficacia de los diferentes métodos estudiados para su aplicación en el género Micromonospora. Una vez determinada la alta diversidad existente en los microorganismos aislados se seleccionaron representantes para realizar un análisis filogenético de los mismos que incluyó además del gen ribosómico 16S, cuatro genes conservados que codifican para proteínas ampliamente utilizados en análisis de secuencias multilocus. Tras el análisis de cada uno de estos genes de forma individual y concatenada, se llevó a cabo el estudio de hibridación de las cepas que podían representar nuevas especies.[EN] In this work we have carried out the isolation of 272 strains, 239 obtained from nitrogen-fixing nodules of Pisum sativum plants and surface sterilized collected in seven different locations in Castilla y León and 33 from the rhizosphere of these same plants. Of these 106 strains were selected and obtained Cañizal Salamanca, 27 and 46 obtained from nodules, and 21 and 12 obtained from rhizosphere, respectively, for analysis of diversity, proving the effectiveness of different methods studied for application in the genus Micromonospora. Once the high diversity in the representative isolates were selected for phylogenetic analysis also included the same 16S rRNA gene, four conserved genes that code for proteins widely used in multilocus sequence analysis. After analyzing each of these genes individually and concatenated, was carried out the study of hybridization of the strains that could represent new species.
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UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA



















AVANCES EN LA SISTEMÁTICA DEL GÉNERO
Micromonospora: ESTUDIO DE CEPAS AISLADAS DE LA
RIZOSFERA Y NÓDULOS DE Pisum sativum









Memoria para optar al grado de doctor presentada por:

LORENA CARRO GARCÍA

Salamanca 2009 MARTHA E. TRUJILLO TOLEDO PROFESOR DOCTOR CONTRATADO
PERMANENTE DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA
DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA Y EUSTOQUIO MARTÍNEZ MOLINA,
PROFESOR CATEDRÁTICO DEL MISMO DEPARTAMENTO,




CERTIFICAMOS:


Que la memoria titulada AVANCES EN LA SISTEMÁTICA DEL GÉNERO
Micromonospora: ESTUDIO DE CEPAS AISLADAS DE LA RIZOSFERA Y NÓDULOS
DE Pisum sativum presentada por Lorena Carro García para optar el grado de Doctor por la
Universidad de Salamanca, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de
Microbiología y Genética de la Universidad de Salamanca.




Y para que así conste, extendemos el presente certificado en Salamanca a 10 de Noviembre
de 2009.









Fdo. Dra. Martha E. Trujillo Toledo Fdo. Dr. Eustoquio Martínez Molina
ÁNGEL DOMÍNGUEZ OLAVARRI CATEDRÁTICO DE MICROBIOLOGÍA Y
DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA DE LA
UNIVERSIDAD DE SALAMANCA,



CERTIFICA:



Que la memoria titulada AVANCES EN LA SISTEMÁTICA DEL GÉNERO
Micromonospora: ESTUDIO DE CEPAS AISLADAS DE RIZOSFERA Y NÓDULOS
DE Pisum sativum presentada por Lorena Carro García para optar al grado de Doctor
por la Universidad de Salamanca, ha sido realizada bajo la dirección de la Dra. Martha
E. Trujillo Toledo y del Dr. Eustoquio Martínez Molina en el Departamento de
Microbiología y Genética de la Universidad de Salamanca.






Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Salamanca a 10 de
Noviembre de 2009.





Fdo. Ángel Domínguez Olavarri.
































Con mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que han colaborado, de una forma u
otra, a que este trabajo llegara a buen puerto.


ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................... 5
1.1. Las leguminosas ............................................................................................... 5
1.2. El guisante (Pisum sativum)............................................................................. 6
1.2.1. Botánica.................................................................................................... 6
1.2.2. Clasificación taxonómica ......................................................................... 8
1.2.3. Desarrollo radicular y nodulación ............................................................ 9
1.2.4. El guisante como alimento ..................................................................... 11
1.3. Actinobacterias ............................................................................................... 12
1.4. Micromonospora............................................................................................. 13
1.4.1. Clasificación taxonómica ....................................................................... 15
1.4.2. Hábitat .................................................................................................... 18
1.4.3. Importancia del género ........................................................................... 19
1.5. Interacción planta-microorganismo................................................................ 20
1.6. Biodiversidad y Taxonomía. .......................................................................... 24
1.6.1. Métodos de tipado para el estudio de la biodiversidad........................... 24
1.6.2. Avances en la taxonomía de procariotas ................................................ 27
2. OBJETIVOS........................................................................................................... 42
3. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................... 44
3.1. Preparación y análisis del entorno de aislamiento de los microorganismos... 44
3.2. Aislamiento de microorganismos ................................................................... 45
3.2.1. Microorganismos aislados a partir de nódulos ....................................... 45
3.2.2. Microorganismos aislados a partir de la rizosfera.................................. 46
3.3. Mantenimiento y conservación de las cepas................................................... 46
3.4. Diversidad genética de los microorganismos aislados ................................... 47
3.4.1. Microorganismos utilizados en el estudio de diversidad genética ......... 47
3.4.2. Recogida de células ................................................................................ 47
3.4.3. Extracción de ADN ................................................................................ 48
3.4.4. Perfiles de BOX-PCR............................................................................. 49
3.4.5. Perfiles de Microsatélites........................................................................ 50
3.4.6. Perfiles de TP-RAPD ............................................................................. 51
3.4.7. Perfiles de ARDRA ................................................................................ 52
3.4.8. Separación de los fragmentos amplificados ........................................... 53
3.4.9. Análisis de los resultados ....................................................................... 54
3.4.10. Análisis de escalado multidimensional................................................... 54
3.5. Análisis multilocus de los microorganismos.................................................. 55
3.5.1. Microorganismos utilizados en el análisis multilocus............................ 55
3.5.2. Obtención de ADN genómico ................................................................ 55
3.5.3. Preparación de las muestras para su amplificación ................................ 58
3.5.4. Secuenciación del gen ribosómico 16S .................................................. 58
3.5.5. Secuenciación del gen que codifica la subunidad B de la girasa (gyrB) 60
3.5.6. Secuenciación del gen que codifica una recombinasa (recA) ................ 61
3.5.7. Secuenciación del gen que codifica la subunidad B de la ARN
polimerasa (rpoB)................................................................................... 62
3.5.8. Secuenciación del gen que codifica la subunidad ß de la atp sintetasa
(atpD) 63
3.5.9. Separación de los fragmentos amplificados ........................................... 63
3.5.10. Purificación de los productos de PCR .................................................... 64
3.5.11. Secuenciación automática de los productos de PCR.............................. 65
3.5.12. Análisis de los fragmentos secuenciados ............................................... 66
1
3.6. Estudios de hibridación ADN-ADN............................................................... 67
3.6.1. Extracción de ADN para la hibridación ................................................. 67
3.6.2. Hibridación ADN-ADN ......................................................................... 69
3.7. Estudio de quimiotaxonomía.......................................................................... 71
3.7.1. Microorganismos utilizados en el análisis quimiotaxonómico............... 71
3.7.2. Recogida de células ................................................................................ 71
3.7.3. Estudio de isómeros del ácido diaminopimélico (DAP) ........................ 72
3.7.4. Contenido en azúcares celulares totales ................................................. 73
3.7.5. Composición del perfil de menaquinonas .............................................. 74
3.7.6. Ácidos grasos.......................................................................................... 75
3.7.7. Lípidos polares ....................................................................................... 76
3.8. Estudios de fisiología ..................................................................................... 79
3.8.1. Microorganismos estudiados .................................................................. 79
3.8.2. Tinción de Gram..................................................................................... 79
3.8.3. Características del cultivo y morfología................................................. 79
3.8.4. Preparación de inóculos.......................................................................... 79
3.8.5. Utilización de fuentes de carbono .......................................................... 80
3.8.6. Pruebas de degradación e hidrólisis........................................................ 80
3.8.7. Pruebas de resistencia a la temperatura .................................................. 82
3.8.8. Pruebas de resistencia al pH ................................................................... 82
3.8.9. Pruebas de resistencia a la salinidad....................................................... 82
3.8.10. Catalasa................................................................................................... 83
3.8.11. Oxidasa ................................................................................................... 83
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................ 86
4.1 Recogida de muestras y análisis del entorno.................................................. 86
4.2 Aislamiento de microorganismos ................................................................... 89
4.2.1. Microorganismos aislados de nódulos.................................................... 89
4.2.2. Microorganismos aislados de rizosfera .................................................. 90
4.3 Estudio de la diversidad genética de los microorganismos aislados .............. 96
4.3.1. Perfiles de BOX-PCR............................................................................. 96
4.3.2. Perfiles de Microsatélites...................................................................... 103
4.3.3. Perfiles de TP-RAPD ........................................................................... 110
4.3.4. Perfiles de ARDRA .............................................................................. 116
4.3.5. Evaluación de las técnicas de tipado analizadas................................... 128
4.3.6. Análisis de escalado multidimensional................................................. 132
4.4 Filogenia del género Micromonospora......................................................... 134
4.4.1. Cepas utilizadas en el análisis de secuencias multilocus...................... 136
4.4.2. Secuenciación del gen ribosómico 16S ................................................ 137
4.4.3. Secuenciación del gen gyrB ................................................................. 147
4.4.4. Secuenciación del gen recA ................................................................. 156
4.4.5. Secuenciación del gen rpoB ................................................................. 164
4.4.6. Secuenciación del gen atpD ................................................................. 172
4.4.7. Análisis conjunto de los genes estudiados............................................ 180
4.5 Estudios de hibridación ADN-ADN............................................................. 188
4.6 Quimiotaxonomía ......................................................................................... 198
4.6.1. Estudio de isómeros del ácido diaminopimélico (DAP) ...................... 198
4.6.2. Contenido en azúcares celulares totales ............................................... 201
4.6.3. Composición del perfil de menaquinonas ............................................ 203
4.6.4. Ácidos grasos........................................................................................ 208
4.6.5. Lípidos polares ..................................................................................... 212
2
4.7 Estudios de fisiología ................................................................................... 219
4.7.1. Microscopía y tinción de Gram ............................................................ 219
4.7.2. Características del cultivo y morfología............................................... 220
4.7.3. Utilización de fuentes de carbono ........................................................ 226
4.7.4. Pruebas de degradación e hidrólisis...................................................... 233
4.7.5. Catalasa y Oxidasa................................................................................ 238
4.7.6. Pruebas de resistencia........................................................................... 238
5. DISCUSIÓN GENERAL ..................................................................................... 245
6. PROPUESTA DE NUEVAS ESPECIES............................................................. 255
7. CONCLUSIONES................................................................................................ 268
8. BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................. 271
APÉNDICE .................................................................................................................. 292
ANEXO I...................................................................................................................... 302
ANEXO II .................................................................................................................... 387
























3












































INTRODUCCIÓN

4 INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Las leguminosas

Las leguminosas son hierbas, arbustos o árboles, anuales o perennes, que forman
una de las mayores familias de angiospermas, con cerca de 700 géneros y 18.000
especies, distribuidas por todo el mundo, aunque son más frecuentes en las regiones
tropicales y subtropicales (Figura 1).

Pertenecen a la familia
Leguminosae, cuyo nombre deriva
del latín legumen (semillas con
vainas). Aunque algunos autores la
han separado en tres familias
independientes –Caesalpiniaceae,
Mimosaceae y Papilionaceae–,
seguiremos el modelo de Flora
Ibérica (Castroviejo, 1999), en el
que se consideran tres subfamilias
(Polhill et al., 1981).

Son plantas dicotiledóneas
caracterizadas por poseer pétalos
libres, frecuentemente en
disposición papilionada, es decir,
Fig. 1. Plantas de leguminosas. con un pétalo superior o estandarte
que envuelve a dos pétalos laterales o alas, y éstas a otros dos pétalos inferiores que en
su conjunto forman la quilla, y por su fruto en legumbre.

Otra característica a destacar en las leguminosas, es su capacidad de establecer
simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno en unos órganos de las raíces llamados
nódulos, lo que hace que los suelos donde habitan sean más fértiles y que sean capaces
5 INTRODUCCIÓN
de crecer en terrenos secos, pobres en nitrógeno o calcáreos, siendo las primeras
colonizadoras tras la degradación de ecosistemas.

Las leguminosas se han cultivado tanto por sus semillas o legumbres comestibles
como para utilizarlas en forrajes e incluso como ornamentales. Además se pueden
extraer a partir de ellas aceites, tinturas o principios activos medicinales (Castroviejo,
1999).

1.2. El guisante (Pisum sativum)

1.2.1. Botánica

El guisante o arveja, Pisum sativum L., es una especie dicotiledónea anual que
pertenece a la familia de las leguminosas y se encuentra mayoritariamente en pastizales,
matorrales, bordes de camino y cultivos.

Posee hojas alternas, pecioladas,
paripinnadas, herbáceas, libres,
semicoradas, semiamplexicaules, con
nerviación pinnado-reticulada y dentadas
al menos hacia la base. Están compuestas
por dos o tres foliolos provistos de
zarcillo que pueden tener el margen
entero o irregularmente aserrado. Todas
las hojas disponen de dos estípulas
insertas en la base del peciolo (Figura 2).

Los tallos son ascendentes o
procumbentes, redondeados y ápteros,
normalmente formados por un solo tallo

dominante. Fig. 2. Ilustración de Pisum sativum.

6

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